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【背景】随着我国人口增长和老龄化的加剧,肿瘤的发病率和病死率正在逐年上升,目前已成为严重危害国民健康的重要原因。据不完全统计,2012年我国新增癌症病例约307万,其中约220万患者死于癌症,预计到2030年,我国新增癌症将达到500万人,这将为我国国民健康和经济带来巨大压力。在我国,目前肝癌的发病率为25.7/10万,其死亡率仅次于胃癌和肺癌。我国是全球肝癌发病率最高和死亡人数最多的国家。因此,深入探讨肝癌发生和进展的调控机制,寻找新的肝癌分子标记物及生物靶向治疗的新靶点,对于我国肝癌的防治具有深远意义。生物节律能够维持机体的生命活动与外界环境变化相协调,对生物的正常生理活动具有重要意义。目前已在人类染色体中定位并克隆出10个核心生物节律基因(CLOCK、NPAS2、BMAL1、PER1、PER2、PER3、CRY1、CRY2、TIMELESS和CKI)。这些核心生物节律基因直接参与调控包括细胞生长、凋亡、代谢、转移和细胞免疫在内的多项细胞重要生命活动,一旦机体的节律基因发生紊乱,则会导致和促进恶性肿瘤的发生及进展。TIMELESS是核心生物节律基因中重要组成成员。它调控包括基因组稳定性、DNA复制、DNA损伤修复、细胞分化等诸多细胞生理活动。TIMELESS的异常与包括胚胎发育、肺及肾脏上皮细胞形态发生、抑郁症、失眠、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、鼻咽癌、白血病及肝癌等多种疾病密切相关。我们前期预实验结果提示TIMELESS分子在肝癌组织中表达显著上调同时促进肝癌细胞葡萄糖的摄取。目前在肝癌中对TIMELESS的研究较少,但是我们的预实验结果提示,节律分子TIMELESS有可能对肝癌的调控发挥重要作用。因此,深入探讨TIMELESS分子对肝癌细胞糖代谢的作用具有重要意义。【目的】1.明确TIMELESS分子在肝癌中的表达及对肝癌患者预后的影响。2.分析TIMELESS分子对肝癌细胞糖代谢的作用。3.阐明TIMELESS分子调控肝癌细胞糖代谢分子机制。【方法】1.以收集的肝癌组织样本及公共肝癌数据为研究对象,利用qRT-PCR、Western Blot和免疫组织化学染色(IHC)分析TIMELESS在肝癌中的表达情况。2.利用葡萄糖摄取、乳酸生成、细胞外液p H值、细胞氧耗等实验,分析TIMELESS对肝癌细胞糖代谢的影响。3.利用q RT-PCR、Western Blot、MTS等方法分析TIMELESS调控肝癌细胞糖代谢的内在分子机制。【结果】1.TIMELESS在肝癌组织中的表达显著高于对应癌旁正常肝组织,TIMELESS表达高的肝癌患者的总生存期及无复发生存期较低表达TIMELESS的患者差。2.TIMELESS分子促进肝癌细胞的糖酵解,抑制线粒体氧化磷酸化。3.肝癌细胞中TIMELESS抑制p53的表达,进而通过p53依赖性的糖酵解通路,促进细胞有氧糖酵解,促进肝癌细胞生长。【结论】通过肝癌组织样本的检测、生物信息学分析、体外细胞学实验,本研究发现肝癌组织中TIMELESS的m RNA及蛋白水平均显著上调,同时其蛋白表达水平与肝癌患者预后呈显著负相关性。TIMELESS通过抑制p53促进肝癌细胞糖酵解、抑制氧化磷酸化,最终促进细胞生长,促进肝癌恶性进展。因此,TIMELESS有望成为未来判断肝癌预后的新分子标志物及治疗的新靶点。