目的和意义系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种可以引起全身多个系统损害的慢性非器官特异性自身免疫性疾病,其血清中含有以抗核抗体为主的大量不同的自身抗体。SLE早期临床表现多种多样,初发时可仅累及单个器官,如皮肤、肾脏、关节等,也可多个器官同时受累。关节及皮肤表现为本病最常见的早期症状,其次是发热、光敏感、雷诺现象、肾炎及浆膜炎等。SLE广泛分布于世界各地,全世界的患病率约为17～48/10万,中国大陆的调查显示SLE的患病率为40～70/10万。SLE好发于青年女性,多见于15～45岁,男女之比1：7～9。SLE的发病原因尚不清楚,目前发现与本病有关的因素主要包括遗传、病毒感染、环境、药物等有关。本病的发病机理迄今尚未完全阐明,但大量研究研究证明SLE是一种自身免疫性疾病,遗传、环境、病毒等多因素的相互作用致使机体自身组织细胞结构发生改变,免疫活性细胞数量及功能异常,从而引起免疫平衡的紊乱,使机体对自身组织产生异常免疫反应(包括体液免疫和细胞免疫),正常组织被自身免疫细胞或自身抗体破坏而发病。SLE产生的自身抗体多种多样,但主要是B细胞对核酸及其结合相关蛋白的应答而产生的IgG型自身抗体,这类抗体的产生需要Th细胞协助。近年大量研究发现CD4+T细胞根据发育、功能及分泌细胞因子的作用不同,分成Th1细胞、Th2细胞、Treg细胞和Th17细胞四个亚群。Th1和Th2细胞为两类重要的介导免疫反应的效应性T细胞,二者相互调控,维持机体免疫稳态。来自国内外不同动物模型及人类SLE的研究显示,SLE患者Th1/Th2偏离方向至今尚未定论。目前关于SLE体内Th1/Th2谁占优势尚无统一定论,Th1优势假说认为Th1细胞与病情活动初期及加重有关；以Th1型免疫紊乱占主导的SLE患者多表现为严重的机体组织损害。Th2优势假说认为Th2细胞及其产生的细胞因子辅助B淋巴细胞活跃产生大量自身抗体,从而导致SLE的发病。目前多认为SLE患者体内存在Th2优势,但也有实验研究发现Th1优势的存在。Th17细胞以分泌IL-17(IL-17A)而得名,除此之外,还分泌IL-17F、IL-21、 IL-22及TNFα,能够诱导局部细胞分泌吸引中性粒细胞的细胞因子和趋化因子,从而在介导慢性炎症、防御胞外细菌感染及自身免疫性疾病等过程中发挥重要作用。调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)是近年在人和小鼠体内发现的具有免疫抑制作用的CD4+T细胞亚群,其可通过不同途径作用于多种靶细胞,对机体免疫应答进行精细的负向调节,从而稳定机体免疫平衡、维持机体免疫耐受。根据其产生的细胞因子、表面标记的不同,Treg细胞可分为CD4+CD25+Treg细胞、Tr1和Th3等多种亚型。CD4+CD25+Treg细胞被认为是调节性T细胞家族中最主要的一群,叉头状家族转录因子(FoxP3)是其特异的标记,在调节性T细胞的发育和发挥功能过程中起到关键作用。许多研究证实FoxP3表达的增加可以诱导CD4+CD25-T细胞向CD4+CD25+Treg细胞分化。介导炎症反应的Th17细胞与介导免疫耐受的Treg细胞都来源于初始T细胞,两者的分化和功能相互抑制,在正常情况下两者保持平衡,以维持机体免疫稳定状态,是对Th1/Th2免疫平衡理论的重要补充。二者失衡则可能导致多种自身免疫性疾病的发生。我们推测Th17细胞/Treg细胞数量和功能的失衡可能参与了SLE的发病及病情的发展。SLE患者大多需要长期使用糖皮质激素、免疫抑制剂,但其诸多毒副作用易造成患者的再次伤害,患者依从性较差。且糖皮质激素的使用遵循严格的禁忌症,如活动性消化道溃疡、严重高血压、精神病、糖尿病、骨质疏松、青光眼及抗菌药不能控制的感染等,同样限制了其临床应用。白芍总苷(total glucosides of paeony, TGP)是近年从传统中药白芍(Paeonia lactiflora Pall)根中提取的有效成分,主要含有芍药苷(Paeoniflorin, PF)、芍药内酯苷(Albiflorin, Alb)、羟基芍药苷、芍药花苷、苯甲酰芍药苷等成分,其中芍药苷含量占总苷的90%以上,一般认为是白芍总苷的主要有效成分。现代药理研究表明,TGP具有多途径调节自身免疫反应,能够抑制单核巨噬细胞产生和分泌炎性细胞因子,清除氧自由基、影响细胞增殖以及抗炎、止痛、抗应激保肝等作用,近年来在临床上已广泛应用于类风湿性关节炎、SLE等风湿免疫性疾病,不良反应轻微且可以耐受。经查阅文献,尚未见关于TGP对SLE背景下Th17/Treg数量影响的报道。流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高新科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析,在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析;能够分类收集并分选某一亚群细胞,分选纯度>95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。本课题利用流式细胞术检测TGP对狼疮鼠外周淋巴组织中Th17/Treg细胞数量的影响。本研究拟采用品系为MRL/1pr的狼疮样小鼠为实验对象,研究有效剂量内不同浓度白芍总苷随用药时间延长对狼疮样小鼠尿蛋白含量及抗ds-DNA的影响,利用流式细胞检测技术观察白芍总苷对狼疮样小鼠脾淋巴细胞中CD4+IL-17+T细胞(Th17细胞)及CD4+CD25+Foxp3+T细胞(Treg细胞)数量的影响,初步探讨白芍总苷对狼疮鼠的治疗作用及对外周淋巴组织Th17/Treg细胞数量的调控作用及免疫机制,进一步完善SLE外周Th17/Treg细胞失衡机制的学说,填补国内外研究关于白芍总苷对SLE背景下Th17/Treg细胞平衡的调控作用理论的空白。研究方法1、采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测IgG型抗ds-DNA抗体浓度。2、采用考马斯亮蓝法检测小鼠尿蛋白含量。3、采用流式细胞术检测不同处理组狼疮小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞、CD4+IL-17+T细胞分别占CD4+T细胞的百分率,计算CD4+IL-17+T细胞/CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例。并分析小鼠尿蛋白分别与Th17/CD4+T细胞、Treg/CD4+T细胞及Thl7/Treg细胞的相关性。研究内容和过程1.实验分组：20只MRL/lpr小鼠购自广东省医学实验动物中心,雌性,3月龄,检疫合格,并且在整个实验过程中,该批小鼠一直饲养于广东省医学实验动物中心SPF级实验动物室内。检测出小鼠血清抗ds-DNA抗体及尿蛋白阳性时确立狼疮发病模型。采用随机数字表法分为TGP高浓度组(7只)、TGP低浓度组(7只)和对照组(6只)。根据《人与动物间体表面积折算的等效剂量比值表》嘲折算,TGP高浓度组按给予121mg/kg的TGP悬液灌胃,TGP低浓度组给予81mg/kg的TGP悬液灌胃,对照组给予同等体积(0.2m1/10g体重)纯净水灌胃,均每天1次,连续4周。2.研究方法：(1)每日定时观察各组小鼠毛发、行为活动、精神状态、摄食、活动等一般情况并每日记录。(2)分别于用药后第0周、第2周末清晨固定时间经眼眶后静脉丛采血0.2-0.3m1,第4周末心脏采血0.2-0.3m1,离心,取血清,-80℃冰箱中保存,酶联免疫吸附法(ELISA)集中检测IgG型抗ds-DNA抗体浓度；同时利用代谢笼收集24小时尿液置于-80℃冰箱中保存,考马斯亮蓝法集中检测尿蛋白含量。(3)于用药4周后集中处死小鼠,解剖取出脾脏,制备脾脏单细胞悬液行流式细胞术检测脾脏CD4+CD25+Foxp3+T细胞、CD4+IL-17+T细胞分别占CD4+T细胞的百分率,计算出CD4+CD25+Foxp3+T/CD4+IL-17+T细胞比例。并分析小鼠尿蛋白分别与Th17细胞、Treg细胞及二者比例的相关性。3.统计学分析：(1)所有数据采用SPSS13.0统计软件处理分析：各计量资料采用均数±标准差(X±S)表示。(2)三个时段各组尿蛋白及抗ds-DNA抗体浓度的比较用采用重复测量设计的方差分析。各个时段内不同处理组之间数据的比较采用单向方差分析。满足方差齐性时,各组均数间的多重比较用LSD方法分析；不满足方差齐性时,使用Welch方法分析,各组间均数间的多重比较使用校正的多重比较方法(Dunnett’ s T3)方法进行分析。(3) CD4+CD25+Foxp3+T细胞、CD4+IL-17+T细胞分别占CD4+T细胞的百分率、及CD4+IL-17+T细胞/CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例的比较使用单向方差分析。方差齐性分析同上。(4)分析尿蛋白分别与CD4+CD25+Foxp3+T/CD4+T细胞、CD4+IL-17+T/CD4+T细胞的百分率及CD4+IL-17+T/CD4+CD25+Foxp3+T细胞的相关性时,采用双变量相关性分析,各组数据均服从正态分布时采用Pearson相关分析,不服从正态分布时则用Spearman相关分析。(5)以P<0.05视为差异具有统计学意义。结果1、一般状况：用药前三组小鼠的摄食活动正常,自主活动灵敏自如,毛发光泽。随着时间的推移,对照组小鼠逐渐出现精神倦怠、喜蜷卧,摄食次数较前减少,活动次数减少,活动灵敏度下降,毛发光泽度下降,其中4只小鼠颈背部毛发脱落明显。TGP低浓度组与高浓度组摄食活动及活动次数、灵敏度较发病前无明显改变,无明显毛发脱落,仅毛发光泽度较前有所下降。实验过程中各组小鼠眼、耳、鼻、口均未见异常分泌物；大便无稀烂,尿量未见异常,尿液肉眼透明；全部小鼠均无死亡。2、抗ds-DNA抗体浓度变化：用药前及用药2周后,三组小鼠的抗ds-DNA抗体浓度无显著差异(P>0.05)；用药四周后,TGP处理组抗ds-DNA抗体水平均显著高于对照组(P=0.000,P=0.000)。TGP高浓度组抗ds-DNA抗体浓度随时间推移呈逐渐上升趋势,第4周末显著高于0周和2周末(P=0.002,P=0.005),第0周与第2周无显著性差异(P=0.835); TGP低浓度组抗ds-DNA抗体浓度在第4周末显著高于0周和2周末(P=0.019,P=0.000),第0周与第2周无显著性差异(P=0.933)；对照组抗ds-DNA抗体水平在三个时间段内呈逐渐上升的趋势,但差异均无统计学意义(P=0.460,P=0.257,P=0.122)。3、尿蛋白浓度变化：用药前及用药2周后,三组小鼠的尿蛋白浓度无显著差异(P>0.05)；用药4周后,TGP高浓度组显著低于TGP低浓度组(P=0.005), TGP高浓度组及低浓度组均显著低于对照组(P=0.014、P=0.04)。TGP高浓度组用药4周后分别与用药2周后、用药前比较,其尿蛋白变化均有显著差异(P=0.003, P=0.006). TGP低浓度组尿蛋白呈现先升高后降低的趋势,但差异无统计学意义。对照组小鼠尿蛋白第4周末分别与第2周末及用药前相比显著升高(P=0.048,P=0.007)。4、脾脏CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞的百分率：脾脏CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞的百分率随着TGP浓魔的增加呈逐渐递增趋势,其水平依次是：0.49±0.13%、0.53±0.04%、0.97±0.20%。其中,TGP高浓度组脾淋巴细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞的百分率分别显著高于TGP低浓度组(P=0.031)与纯净水对照组(P=0.025), TGP低浓度组高于对照组,但差异无统计学意义(P=0.84)。5、CD4+IL-17+T细胞占CD4+T细胞的百分率：脾淋巴细胞中CD4+IL-17+T细胞占CD4+T细胞的百分率随着TGP浓度的增加呈逐渐递减趋势,其水平分别是：6.02±3.06%、4.63±1.21%、3.20±0.83%,但各组差异均无统计学意义(PH-C=0.598, PH-C=0.321, PL-C=0.607, P>0.05)6、脾淋巴细胞中脾淋巴细胞中CD4+IL-17+T/CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例：脾淋巴细胞中CD4+IL-17+T/CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例随着TGP浓度下降呈上升趋势,其水平分别是：4.27±1.28、8.91±2.20、12.38±3.82。TGP高浓度组CD4+IL-17+T/CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例显著高于对照组(P=0.049), TGP低浓度组低于纯净水对照组、高于TGP高浓度组,但差异无统计学意义(P=0.357、P=0.224)。7、三组小鼠尿蛋白分别与CD4+IL-17+T/CD4+T细胞、CD4+CD25+Foxp3+T/CD4+T细胞及CD4+IL-17+T/CD4+CD25+Foxp3+T细胞行相关性分析。CD4+CD25+Foxp3+T/CD4+T细胞百分率与小鼠尿蛋白浓度呈显著负相关(r=-0.481, P=0.032); CD4+IL-17+T/CD4+CD25+Foxp3+T细胞比值与尿蛋白浓度呈显著正相关(r=0.609, P=0.006); CD4+IL-17+T/CD4+T细胞百分率与尿蛋白无显著相关性(r=0.301,P=0.198)。结论1、TGP能够改善MRL/lpr狼疮样小鼠的一般情况,如维持正常的精神状态、摄食活动、保持毛发光泽度、自主活动灵敏度等,提示TGP对小鼠狼疮样病变状态具有一定的改善,可以提高狼疮样小鼠的生存质量。2、TGP能够减少SLE模型小鼠尿蛋白含量,且在有效剂量内随着用药剂量越大,用药时间越长,其效果越显著。3、TGP组狼疮鼠外周血抗ds-DNA抗体升高,同时其尿蛋白含量减少,提示TGP改善狼疮肾脏损害,起到保护肾脏的作用在用药早期可能并非通过减少抗ds-DNA抗体实现。抗ds-DNA抗体可能并非狼疮肾的唯一致病因素。4、TGP能够降低狼疮鼠脾脏CD4+IL-17+T细胞水平,提高CD4+CD25+Foxp3+T细胞水平,使Thl7/Treg细胞比值降低,并呈药物浓度依赖性,提示TGP能够负向调节狼疮小鼠Thl7/Treg细胞平衡,进而发挥抗炎和免疫调节的作用。5、外周CD4+CD25+Foxp3+T的数量与小鼠尿蛋白浓度呈显著负相关,提示CD4+CD25+Foxp3+T参与保护狼疮肾脏损害。CD4+IL-17+T/CD4+CD25+Foxp3+T细胞比值与狼疮鼠尿蛋白浓度呈显著正相关,提示SLE患者可能存在Th17/Treg细胞免疫失衡,且与肾脏损害有关。6、TGP具有调节SLE Th17/Treg免疫平衡的能力。其中TGP上调Treg细胞的能力较下调Th17细胞明显,提示TGP可能是先通过上调Treg细胞至一定程度后再通过Treg/Th17免疫系统,调节Th17的分化。7.在Thl/Th2/Th17/Treg免疫平衡中,TGP早期可能促进Th2、Treg,随着用药时间的延长,再通过Treg细胞负向调节Th1/Th2/Th17。