生物的寿命受到遗传和环境的影响，利用模式生物对衰老相关基因的研究已取得一定的成果，这些研究已经初步阐明寿命受某些特定基因调控。人载脂蛋白E(APOE)基因与人类寿命密切相关。载脂蛋白E是34kDa大小的多功能分子，由299个氨基酸组成，是乳糜微粒、极低密度脂蛋白、中等密度脂蛋白和部分高密度脂蛋白的组分，通过低密度脂蛋受体途径调控脂蛋白代谢，在脂类代谢中发挥重要作用。中枢神经系统中的APOE对脑组织淀粉样蛋白的沉积与清除、免疫调节、氧化应激等都有潜在的作用，APOE在体内发挥十分重要的生物学活性。本研究根据功能基因组学和生物信息学，研究了猪APOE基因的表达调控，主要的研究成果如下： ⑴本研究获得长度为1693bp的猪APOE基因5’调控区序列。生物信息学分析5’调控区发现存在许多重要的调控元件，包括—33bp处的TATA box、—49bp处2个GC box以及CACCC—box、E—box和X—box等。 ⑵采用PCR—测序方法，对猪APOE基因外显子4进行SNP筛查发现：第227位碱基发生了C→T转换，这一变异导致相应蛋白质序列中的氨基酸发生了亮氨酸和脯氨酸替换。其基因型在大花白中CC型频率为42％，CT型频率为30％，TT型频率为28％，而长白猪CC型为100％。 ⑶采用不同品种PCR混合样测序方法，对猪APOE基因5’调控区进行SNP筛查，发现该区域存在3个突变位点，分别是：—419G/A、—134 T/A及+523A/T。进一步对3个位点所在基因组DNA区域的转录因子结合位点预测分析发现，419G>A及+523A>T所在区域突变前后不存在潜在的核转录因子结合位点。而—134位点是核转录因子Pur—alpha、MAZF、EGRF、EKLF与APOE顺式作用元件结合的核心位点。当T>A突变时，由GA box突变成CACCC box。 ⑷通过对—134T/A位点的SNP筛查发现，T等位基因及A等位基因频率在中外猪种(大花白、蓝塘、长白和大白)的分布非常接近，都表现为T等位基因占优势，频率在0.60～0.80之间，而A等位基因的频率在0.20～0.40之间。 ⑸采用RT-PCR方法对猪APOE基因在不同代数的—134多态位点TA基因型的猪胎儿成纤维细胞表达谱进行分析，结果表明： APOE在第一代猪胎儿成纤维细胞中的表达量最高，随着细胞代数的增加，表达量逐渐下降，到第50代表达量为最低。同时对猪APOE在蓝塘猪和长白猪的13个组织中的表达谱进行了研究，结果显示APOE基因主要在肝和脑组织表达，其它外周组织如脾、肺、肾、大肠、小肠也有不同程度的表达，而在心、胃、背肌和淋巴中几乎不表达。 ⑹采用实时荧光定量PCR对APOE—134T/A多态位点不同基因型的mRNA表达量分析发现：①APOE在TT型长白和大花白猪的肝组织平均表达量分别为0.628±0.09和0.613±0.06，差异不显著；②APOE在不同基因型的大花白猪的肝组织的平均表达量最高为AA型6.85±0.41，其次为TA型3.63±0.52，最低为TT型0.628±0.09，基因型间的表达量差异极显著。—134位点等位基因A显著促进APOE基因的表达水平。 ⑺通过定向克隆的策略，构建了覆盖APOE基因5’调控区起始密码子ATG上游1700bp区域的一系列APOE启动子荧光素酶报告基因重组体。启动子活性分析表明，荧光素酶报告基因各重组体在Hela细胞的活性远低于在猪胎儿成纤维细胞中的活性，但各重组体在两种细胞中的活性大小趋势一致，都表现为P4(—254/+874)活性最高，P5(+11/+874)几乎无活性。综合所有荧光素酶报告基因活性检测结果，将核心启动子定位于—254/+11区域内。SNP—134多态位点不同基因型的核心启动子活性检测表明，A型的活性比T型高6.8倍。 ⑻利用在线软件预测分析，发现猪APOE基因5’调控区存在两个CpG岛。通过使用MSP引物进行PCR扩增及测序分析，发现两CpG岛存在不同程度的甲基化状态，进而对启动子活性产生不同程度的影响。 ⑼通过对猪APOE关键顺式作用元件的鉴定，结果表明：SNP—134位点前后一段序列是极为关键的上游调控元件，该SNP位点是具有重要功能的多态位点。—134位点突变前后都为顺式作用元件的核心碱基。当T突变为A时，反式作用因子与顺式作用元件的亲和力提高，同时所结合的反式作用因子也有一定的改变。当SNP—134A顺式作用元件被激活时，猪APOE的表达显著上调。因此该突变是功能性的突变。