研究背景和目的:脑卒中已成为当今第三大死亡原因及首位致残原因。据统计我国脑卒中发病率高达120/10万,致残率高达75%。缺血性脑卒中(脑梗死)占全部脑卒中的60%~80%。长时间的脑缺血将导致广泛的、非选择性的神经元坏死。而短暂的脑缺血事件后,虽然血供随之恢复,但在人类和一些动物模型都可以引起选择性的神经元死亡,主要影响海马CA1区的锥体神经元,这种死亡甚至可发生于再灌注28天后,称为神经元迟发性死亡(Delayed neuronal death,DND)。脑卒中致残的程度与DND密切相关,而DND的发生发展是一个复杂的,多种病理机制参与的过程,其机制尚未能完全阐明,因而缺乏理想的治疗手段。DND的发生机制虽未被充分了解,但研究发现神经凋亡在其中扮演了重要的角色。Pulsinelli建立的大鼠短暂性前脑缺血/再灌注模型是目前国际上研究缺血性脑损伤后继发性神经元死亡机制普遍采用的模型之一,先行通过手术阻断椎动脉,次日短暂夹闭颈动脉(15分钟)进行缺血/再灌注,由于通过Willis环的血供仍然保留,对脑干功能无明显影响。在这一模型中,再灌注后大鼠海马发生特异性病理学改变:CA1区锥体细胞发生迟发性神经元死亡(即脑缺血/再灌注2～3天后光镜下才见到CA1区锥体细胞的死亡),而CA3区的锥体细胞和齿状回颗粒细胞却几乎不受损害。而CA1区锥体细胞发生迟发性神经元死亡中,凋亡发挥了重要作用。ephrin(配体)-Eph(受体)系统属于受体酪氨酸激酶家族。Eph-ephrin系统的受体分为EphA与EphB两个亚族,相应的配体也分为ephrinA (A1～A5 )与ephrinB (B1～B3 )两个亚族。ephrinA配体具有一个胞外保守的受体结合区,通过糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)形式锚定于细胞膜。Eph受体胞外域含配体结合区、半胱氨酸富集区与两个纤连蛋白Ⅲ型区,胞内域包括酪氨酸激酶区、SAM及PDZ结合区。EphA受体优先结合ephrinA, EphB优先结合ephrinB,但EphA4除与ephrinA结合外也可与ephrinB1和ephrinB2相结合。Eph-ephrin信号传递依赖复合物的寡聚化,游离的单体不具有生理作用。该系统在神经系统发育以及突触可塑性调控中起重要的作用。近期研究发现它们可能也与缺血损伤有关。研究显示ephrinA3是成年海马区最为丰富的Eph配体,主要位于GFAP阳性的星形胶质细胞上, EphA4分布于海马神经元特别是CA1区的锥体神经元上。而在病理情况下,CA1、CA3区及DG的锥体细胞层均可表现出强烈的缺血诱导的ephrinA3的表达。在未成年的大鼠,缺血缺氧可使EphA4下降,也有研究发现慢性脑缺血时EphA4上调,但EphA4-ephrinA3在缺血损伤中的作用尚不明确,此外它是否参与神经元的凋亡及其信号通路亦不明确。ephrin配体活化Eph受体的信号传递包括MAPK,PI3激酶等多种下游信号通路。已有研究发现MAPKs,包括ERK1/2,JNK和p38 MAPK,广泛参与了神经元存活和凋亡调控过程,包括在缺血/再灌注损伤后神经元存活与死亡的调控。那么缺血/再灌注后通过EphA4-ephrinA3活化的MAPKs是否参与损伤后神经元凋亡亦不明确。除上述信号通路参与对细胞增殖及凋亡的调节外,细胞的容积变化也在细胞的增殖、凋亡过程发挥作用。参与容积调节的主要是离子通道包括K+通道,Cl-通道等。近年来的研究表明,容积调节性Cl-通道通过对细胞容积、膜电位的调节在细胞凋亡过程中发挥了重要作用。但氯离子通道活动的调控机制尚未完全阐明,有研究提示蛋白酪氨酸磷酸化信号参与了容积调节性氯通道的调节,应用氯通道阻断剂或酪氨酸激酶抑制剂可明显减少短暂脑缺血/再灌注后海马神经元的凋亡。由于EphA4-ephrinA3属于酪氨酸激酶家族,它们是否可以通过影响氯通道功能在缺血/再灌注损伤中发挥作用呢?综上所述,我们拟通过建立短暂前脑缺血/再灌注模型进行以下研究:1.通过检测缺血/再灌注诱导的凋亡及EphA4-ephrinA3在海马区的表达变化,观察EphA4-ephrinA3系统在缺血/再灌注后神经元凋亡过程发挥的作用; 2.通过记录氯通道电流及应用相应的激动剂、拮抗剂,观察EphA4-ephrinA3是否通过对海马CA1区氯通道的调控参与了神经元凋亡的过程;3.通过检测MAPKs信号通路中各途径(ERK,JNK、P38 MAPK)的表达,分析EphA4-ephrinA3参与缺血/再灌注损伤的信号转导通路。一、EphA4-ephrinA3在缺血/再灌注损伤后大鼠脑海马神经元迟发性死亡的作用观察目的:建立大鼠全脑短暂缺血/再灌注模型,观察大鼠海马组织CA1区神经元的损伤(凋亡)情况,以及在此过程EphA4-ephrinA3表达的变化。为进一步研究EphA4-ephrinA3对于缺血/再灌注后CA区神经元凋亡的作用,分别通过侧脑室给予EphA4受体激动剂ephrinA3-Fc,以及受体阻断剂EphA4-Fc,观察EphA4-ephrinA3系统在脑缺血/再灌注诱导的CA1区神经元凋亡过程的作用。方法:1选取成年雄性Wistar大鼠,随机分为以下各组:伪手术(sham)组(各时间点n=6),先行灼闭双侧椎动脉,次日打开颈部切口但不夹闭颈动脉;缺血/再灌注组(各时间点n=6),先行灼闭双侧椎动脉,次日夹闭双侧颈动脉15分钟后松开动脉夹实现再灌注,6、24、48小时取材检测;Vehicle+缺血/再灌注组(各时间点n=6),侧脑室给予无菌PBS10μl,于再灌注后6、24、48小时取材检测;ephrinA3-Fc+缺血/再灌注组(各时间点n=6),给予ephrinA3-Fc,再灌注后6、24、48小时取材检测;EphA4-Fc+缺血/再灌注组(各时间点n=6),给予EphA4-Fc,再灌注后6、24、48小时取材检测;2建立大鼠前脑短暂缺血/再灌注模型,药物干预组缺血前经侧脑室内给予可溶性融合蛋白ephrinA3-Fc以激活EphA4受体,或者给予可溶性融合蛋白EphA4-Fc阻断体内EphA4-ephrinA3相互作用。留取海马组织,通过克紫染色观察海马神经元损伤情况;分别采用原位末端标记法(TUNEL)、Caspase 3活性测定法检测大鼠海马组织中神经神经元凋亡的情况;以Western blot方法检测大鼠海马组织中EphA4与ephrinA3的表达水平变化。从而了解EphA4与ephrinA3在大鼠脑缺血/再灌注后神经元损伤过程中的表达变化。结果:1.短暂脑缺血/再灌注可以引起海马CA1区神经元迟发性死亡。在再灌注后不同时间点取海马组织进行尼氏染色,观察到进行性的CA1区神经元丢失。至缺血/再灌注后7天,CA1区细胞带消失,提示CA1区神经元大量死亡。Caspase 3活性在缺血/再灌注后6小时即有升高,随着时间推移在24小时及48小时继续升高。各时间点(OD值分别为2.3±0.19,2.2±0.28,1.9±0.015)与sham组(OD值为1.1±0.017)比较均具有显著性差异(P<0.05)。TUNEL染色的结果与Caspase3的结果类似,在三个时间点TUNEL染色的阳性率分别为24.5±5.36,22.3±4.76,23.8±4.17),与sham组(5.33±3.33)比较均具有统计学意义(P<0.05)。上述结果提示,短暂脑缺血/再灌注可以引起海马CA1区神经元凋亡增加2.短暂脑缺血/再灌注后大鼠海马组织EphA4与ephrinA3蛋白表达均显著增加实验结果显示,与对照组相比,海马缺血/再灌注后6小时海马CA1区组织中ephrin A3的表达水平显著增高(IOD值为2.05±0.12 vs 0.78±0.02,P<0.05),随后明显减少,但在再灌注24 h与对照相比仍有显著差异,再灌注48 h逐渐回复至对照组水平。EphA4也出现了由缺血诱导的增高,再灌后6小时与对照组相比即有明显增高(2.21±0.12 vs 0.72±0.03, P<0.05 ),之后逐渐下降,再灌注后24小时与对照相比仍有明显差异,至48小时与对照组相比无明显差异。3.侧脑室内给予EphA4受体激动剂促进神经元的凋亡当侧脑室内给予激动剂ephrinA3-Fc后,Caspase 3的活性较单纯缺血/再灌注组有明显升高(6 h: 2.76±0.15 vs. 2.28±0.28,P<0.05;24 h:2.24±0.24 vs. 2.20±0.19,P<0.05;48 h:2.04±0.44 vs. 1.90±0.29,P<0.05),同时TUNEL染色阳性细胞亦有增加(6 h: 31.8±4.40% vs. 26.33±5.32%,P<0.05;24 h:25.50±4.03% vs. 23.8±5.56%,P<0.05;48 h:22.17±4.52% vs. 19.0±4.34%,P<0.05)。4.侧脑室给予EphA4受体阻断剂抑制神经元的凋亡当侧脑室内给予阻断剂EphA4-Fc后,Caspase 3的活性较单纯再灌注组降低(6 h:1.73±0.30 vs. 2.28±0.28;24 h:1.52±0.26 vs. 2.20±0.19;48 h:1.43±0.23 vs. 1.90±0.29,P<0.05),而TUNEL染色阳性细胞亦明显减少(6 h:17.5±4.97% vs. 26.33±5.32%;24 h:15.0±4.47% vs. 23.8±5.56%;48 h:12.0±3.46% vs. 19.0±4.34%,P<0.05),提示EphA4-ephrinA3系统的活化可能参与了再灌注后神经元凋亡的发生。小结:1.短暂缺血/再灌注可导致海马CA1区神经元的迟发性死亡;2.缺血/再灌注引起的神经元凋亡是导致海马CA1区神经元迟发性死亡的重要原因,而且神经元凋亡主要是Caspase依赖性的;3.短暂脑缺血/再灌注可诱导海马CA1区EphA4与ephrinA3的表达明显增高,其时间过程与Caspase增高的时间过程一致,提示EphA4与ephrinA3的表达增高在CA1区神经元损伤过程中发挥重要作用。4. EphA4与ephrinA3参与了缺血/再灌注后海马区神经元的凋亡过程,激活EphA4可导致神经元的凋亡增加,而阻断EphA4的作用可部分抑制再灌注后海马区神经元的凋亡。二、EphA4-ephrinA3系统通过调控外向整流氯离子通道在缺血/再灌注损伤中发挥作用目的:已有研究显示,在中枢神经系统,氯通道的活动与神经元损伤及凋亡有密切关系。海马CA1区锥体神经元缺血损伤后外向整流氯离子通道(ORCC)功能活动增强,可能通过改变细胞容积引起神经元的凋亡。而应用氯离子通道阻断剂可以抑制脑缺血后引起的迟发性神经元死亡。另有研究显示ORCC的活化可由酪氨酸激酶受体介导。EphA4为在海马区表达丰富的酪氨酸激酶受体,设想也可能对氯通道功能产生影响,从而参与神经元凋亡过程。本实验通过制备缺血/再灌注大鼠海马脑片,并对锥体神经元进行全细胞脑片膜片钳记录,利用具有相对完整神经元和胶质细胞网络的大脑切片中,分别给予EphA4受体阻断剂EphA4-Fc和激动剂ephrinA3-Fc,观察EphA4-ephrinA3系统通过对氯通道功能的影响在缺血/再灌注损伤中发挥的作用。方法:选择出生后21- 25天健康雄性Wistar大鼠。体重180 ~ 250 g。伪手术组(n=6),进行伪手术并制备脑片后正常人工脑脊液孵育并行电生理记录;缺血/再灌注6小时组(n=6),制备缺血/再灌注模型,并在再灌注后6小时制备脑片,进行电生理记录;缺血/再灌注24小时组(n=6),制备缺血/再灌注模型,并在再灌注后6小时制备脑片,进行电生理记录;EphA4-Fc组+伪手术组(n=6):伪手术后6小时制备脑片,在记录前给予EphA4-Fc孵育10分钟;EphA4-Fc组+再灌注组:再灌注后6小时制备脑片,在记录前给予EphA4-Fc孵育10分钟;ephrinA3-Fc组+伪手术组(n=6):伪手术后6小时制备脑片,在记录前给予ephrinA3-Fc孵育10分钟;ephrinA3-Fc组+再灌注组(n=6):再灌注后6小时制备脑片,在记录前给予ephrinA3-Fc孵育10分钟;ephrinA3-Fc及EphA4-Fc以PBS配制高浓度贮存液,使用时以人工脑脊液稀释使终浓度为10μg/ml。结果:1.短暂脑缺血后大鼠海马CA1区锥体神经元外向整流氯通道的功能增强,表现为氯电流增加。短暂脑缺血后大鼠海马CA1区锥体神经元外向整流氯通道电流持续增强。缺血后6小时和24小时的全细胞电流从正常的9.11±1.2pA/pF (-80mV)和64.2±6.9pA/pF (80mV)分别增强为15.80±1.70、17.70±1.93 pA/pF (-80mV)和120.16±12.3、129.82±11.83 pA/pF (+80 mV) (n=15,p <0.05 ),与对照组相比电流明显增强。2.EphA4受体激动剂ephrinA3-Fc增强外向整流氯通道电流在正常脑片上给予EphA4受体激动剂ephrinA3-Fc后,氯通道电流有轻微升高,但与正常对照相比,差异无显著性。但在缺血/再灌注后6小时的脑片上,激动剂ephrinA3-Fc可使大鼠海马CA1区锥体神经元外向整流氯通道的功能明显增强。以EphA4-Fc孵育脑片10分钟后进行全细胞膜片钳记录,与单纯缺血/再灌注时记录到的电流(15.80±1.70 pA/pF)相比有显著差异。结果显示,ephrinA3-Fc可使外向整流氯通道电流进一步增加,分别为16.980±1.9pA/pF (-80mV)和132.35±10.33 pA/pF (80mV),与缺血/再灌注组相比,差异具有显著性。。3.EphA4受体阻断剂EphA4-Fc抑制外向整流氯通道电流在正常脑片上给予EphA4受体阻断剂EphA4-Fc后,同样未观察到氯通道电流的显著变化。但在缺血/再灌注后6小时的脑片上,EphA4受体阻断剂EphA4-Fc可使外向整流氯通道电流下降。以EphA4-Fc孵育脑片10分钟后进行全细胞膜片钳记录,与单纯缺血/再灌注时记录到的电流(15.80±1.70 pA/pF)相比有显著差异。结果显示,EphA4-Fc可使外向整流氯通道电流下降,分别为13.30±1.3pA/pF (-80mV)和113.35±7.33 (80mV),与缺血/再灌注组相比,差异具有显著性。小结:1.脑缺血后大鼠海马CA1区锥体神经元外向整流氯通道功能活动持续性增强。2.给予EphA4受体激动剂和阻断剂可影响缺血/再灌注后外向整流氯通道的电流。激动剂使通道电流进一步增加,而阻断剂可部分抑制通道电流。提示EphA4-ephrinA3系统可通过对氯通道影响在缺血/再灌注损伤中发挥作用。三、EphA4-ephrinA3系统在脑缺血再灌后神经元迟发性死亡过程中的信号通路-MAPKs通路研究目的:ephrin配体活化Eph受体的信号传递包括Rho GTPases,MAPK,Src激酶和PI3激酶等多种下游信号通路。其中MAPKs包括ERK1/2,JNK和p38 MAPK,在多种病理情况下参与了神经元存活和凋亡的调控过程。因此,我们拟通过建立短暂前脑缺血/再灌注模型并给予EphA4-Fc或ephrinA3-Fc,观察在大鼠脑海马缺血/再灌注损伤后MAPKs信号通路中P38、ERK1/2及JNK的变化,及其与EphA4-ephrinA3系统表达变化的关系,以分析MAPKs信号通路各途径在EphA4-ephrinA3系统中的作用。方法:1.选取成年雄性Wistar大鼠,分组同第二部分。2.建立大鼠全脑短暂缺血/再灌注模型,在缺血前侧脑室内给予可溶性融合蛋白ephrinA3-Fc以激活EphA4受体,或者给予可溶性融合蛋白EphA4-Fc阻断体内EphA4-ephrinA3相互作用,在再灌注后不同时间点留取海马组织,以Western blot方法检测大鼠海马组织中中P38、ERK1/2及JNK的表达变化,并分析其意义。结果:1.缺血/再灌注可引起p-P38在CA1区表达增高,再灌注6小时即与对照组有显著差异(0.83±0.18 vs 0.45±0.23,P<0.05)。给予ephrinA3-Fc后缺血/再灌注诱导的p-P38表达升高更为显著(分别为1.23±0.14,1.65±0.13,2.09±0.07),而EphA4-Fc对再灌注后p-P38的表达未产生明显改变。2缺血/再灌注可诱导海马CA1区ERK1/2的活化,在各检测的时间点表达逐渐增高,但侧脑室给予EphA4-Fc及ephrinA3-Fc均不影响缺血/再灌注所诱导的表达升高。3缺血/再灌注可诱导海马CA1区p-JNK的活化,在再灌注后6小时有明显升高,再灌注后48小时恢复正常水平,侧脑室给予EphA4-Fc及ephrinA3-Fc均不影响缺血/再灌注所诱导的表达升高。小结:1. EphA4-ephrinA3系统参与缺血/再灌注损伤的作用与与MAPK通路的活化密切相关,尤以P38途径的作用重要,但给予阻断剂EphA4-Fc未明显抑制P38的活化,其原因有待进一步研究;2. ERK1/2与JNK途径参与了缺血/再灌注损伤的过程(缺血/再灌注均可使其活化),但在EphA4-ephrinA3系统中可能不发挥作用。结论:1、短暂缺血/再灌注引起海马CA1区神经元的迟发性死亡,以Caspase依赖的神经元凋亡为主。2、在缺血/再灌注诱导的神经元凋亡过程EphA4-ephrinA3系统发挥了重要作用,该系统由此参与缺血/再灌注诱导的神经元损伤。3、在缺血/再灌注引起的神经损伤过程,EphA4-ephrinA3加强了外向整流氯通道的活动使氯通道电流增加,这可能是EphA4-ephrinA3引起神经元凋亡的重要因素之一。4、MAPKs通路介导了EphA4-ephrinA3在缺血/再灌注损伤中的作用,其中P38途径的作用尤为重要。