论文部分内容阅读
家蚕质型多角体病毒（BmCPV）属于呼肠孤病毒科,是一种双链RNA病毒,由10个dsRNA病毒片段组成,每个片段都有其完整的开放阅读框（ORF）。编码6个结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7）,3个非结构蛋白（p101（NSP5）,p44（NSP8）,NS5（NSP9））和一个多角体蛋白。由于BmCPV的基因组结构的特殊性和缺乏敏感细胞系,阻碍了BmCPV基因组各片段的功能研究。为了突破这一瓶颈,本研究旨在建立一个反向遗传学系统,为BmCPV的基因功能的深入研究提供技术手段。本研究基于已构建的分别含有T7聚合酶启动子控制的BmCPV10个基因组片段cDNA序列的重组质粒,重组质粒进行线性化处理后,共转染进稳定表达T7 RNA聚合酶的BmN转化细胞中,结果显示,细胞表现出明显的病理变化。进一步,共转染培养细胞上清转接BmN细胞,Real-time PCR可检测到BmCPV vp1基因的表达;Western blot细胞免疫荧光均可检测到BmCPV蛋白的表达,表明重组病毒（rBmCPV）拯救成功。重组病毒rBmCPV经口接种家蚕,患病家蚕中肠后部呈乳白色,镜检可观察到多角体;Real-time PCR结果进一步证实重组病毒可以在中肠中进行复制增殖,表明已成功构建了基于重组质粒的BmCPV反向遗传学系统。禽流感病毒（AIV）是一种甲型流感病毒,具有8种不同的负链RNA片段,属于正粘病毒科。流感病毒感染宿主细胞后,病毒的抗原表位被宿主的免疫细胞受体识别,产生免疫应答。我们曾根据计算机软件预测出不同亚型AIV的T细胞与Th、B细胞抗原表位氨基酸序列,参考杆状病毒优势密码子进行优化,人工合成得到相应的核苷酸序列CTLT和THB,进一步用P10启动子控制CTLT序列、CMV启动子控制THB序列,利用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒rBac-CMV-THB-CTLT。本研究在此基础上,通过PCR、Western blotting、细胞免疫荧光证实,抗原表位CTLT能在重组杆状病毒在感染家蚕细胞的中表达;rBac-CMV-THB-CTLT能进哺乳类HEK293t细胞,并表达抗原表位THB。进一步,将重组病毒rBac-CMV-THB-CTLT免疫鸡和小鼠,间接ELISA、免疫组化、T淋巴细胞增殖反应、脏器系数等结果均表明,rBac-CMV-THB-CTLT能引起鸡和小鼠针对H7抗原的特异性体液免疫反应和细胞反应。研究结果为禽流感病毒的多抗原位口服疫苗的应用奠定了基础。