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克罗恩病(CD)是一种病因不明的胃肠道慢性非特异性炎症性疾病。本病不同程度地影响患者的消化吸收和营养状况,并易造成肠梗阻、穿孔以及肠瘘等严重并发症。虽然国际上己对其进行了多年的深入研究,但尚无令人满意的治疗手段,治疗药物有限,副作用大,效果不满意。卫矛科植物雷公藤是祖国传统医学中一种常用的中草药,对多种免疫性疾病有显著的疗效,如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等。多年来,我科应用雷公藤复合物-雷公藤多甙治疗CD患者,取得了令人满意的临床疗效,但目前国内外尚罕见雷公藤用于CD治疗的作用机理研究。雷公藤甲索(Triptolide,PG490)是从雷公藤中分离出的活性最高的环氧化二萜内酯化合物,具有明显的抗炎和免疫抑制活性。IL-10基因敲除(IL-10-/-)小鼠是公认较好的CD动物模型。本实验以IL-10-/-小鼠为动物模型,观察并探讨雷公藤甲素对IL-10-/-小鼠慢性肠炎的治疗作用,并进一步研究雷公藤甲素对于IL-10-/-小鼠肠粘膜免疫的调节作用,为中药雷公藤及其有效成分在CD治疗的临床应用提供理论依据。本研究分为三个部分：
第一章：雷公藤甲素对白介素10基因敲除小鼠慢性肠炎发生发展的影响。
背景：IL-10-/-小鼠出生4周后可自发慢性肠炎,其发病机制、病变特征接近人类CD。观察雷公藤甲素给药后,对IL-10-/-小鼠慢性肠炎的发生发展是否有抑制作用。
方法：建立IL-10-/-小鼠慢性肠炎模型。选取4-5周龄雄性IL-10-/-小鼠,等量分为给药组和对照组,给药组腹腔注射雷公藤甲素,对照组腹腔注射相同剂量生理盐水,连续8周,观察小鼠体重变化、结肠形态学和组织病理学改变,测定血清SAA水平,评估炎性活动度。
结果：雷公藤甲素可明显提高IL-10-/-小鼠体重增长率,显著改善结肠慢性炎症损伤,降低组织学评分(4.625±1.061 vs7.250±1.669,P＜0.01)及血清SAA水平(17.845±3.667 vs34.470±5.645,P＜0.01)。
结论：雷公藤甲素能够抑制IL-10-/-小鼠慢性肠炎的发生发展,有一定的治疗作用。
第二章：雷公藤甲素对白介素10基因敲除小鼠肠粘膜免疫的调节。
目的：观察雷公藤甲素对于IL-10-/-小鼠肠粘膜Th1免疫反应的调节作用；通过对IL-10-/-小鼠肠道TNFR1/2信号通路的研究,进一步探讨雷公藤甲素用于治疗慢性肠炎的作用机理。
方法：选取4-5周龄雄性IL-10-/-小鼠,等量分为给药组和对照组,给药组腹腔注射雷公藤甲素0.07mg/kg,对照组腹腔注射相同剂量生理盐水,连续8周,取结肠组织,免疫荧光法观察雷公藤甲素对肠粘膜局部CD4+T细胞、CD11c+细胞浸润的调控,酶联免疫吸附测定(Eiisa)结肠组织IFN-γ水平,实时定量聚合酶链反应实验(RT-PCR)测定结肠组织IL-12 p35、IL-12/23 p40、IL-23 p19 mRNA基因表达水平；Elisa法测定结肠组织TNF-α水平,RT-PCR法测定结肠组织TNFR1、TNFR2 mRNA基因表达水平,电泳迁移率变动分析实验(EMSA)测定结肠组织NF-κB活性。
结果：雷公藤甲素减少了IL-10-/-小鼠肠粘膜CD4+T细胞、CD11c+细胞的浸润分布,显著降低组织lFN-γ蛋白水平(17.106±3.391 vs24.68±5.539,P＜0.01)、IL-12及IL-23基因表达；雷公藤甲素显著降低结肠组织TNF-α蛋白水平(TNF-α38.474+8.767 vs19.048+5.473,P＜0.01)及TNFR2 mRNA基因表达,并抑制结肠组织NF-κB活性。雷公藤甲素对TNFR1基因表达亦有抑制作用,但活性明显低于对TNFR2。
结论：雷公藤甲素能够抑制Th1肠粘膜免疫的过度活化,抑制肠道慢性炎症的发生发展；雷公藤甲素能够通过干扰TNF-α/TNFR2-NF-κB信号通路,抑制肠道炎症的发生发展。根据其对TNFR的不同活性,我们推测雷公藤甲素在安全性方面具有潜在优势。
第三章：雷公藤甲素对成年白介素10基因敲除小鼠已确定性肠炎治疗及相关机制研究。
目的：研究雷公藤甲素对成年IL-10-/-小鼠已确定性肠炎的治疗作用,评估其用于克罗恩病诱导缓解治疗的可能性,并进一步探讨相关作用机理。
方法：选取15-16周龄,雄性lL-10-/-小鼠,随机等量分为给药组及对照组。给药组每日腹腔注射雷公藤甲素,对照组每日腹腔注射等量生理盐水,共给药2周,通过临床评分、组织病理学评估结肠炎症程度改变,Elia法测定结肠组织IL-4水平,Western blot方法测定结肠组织Toll样受体4(TLR4)的蛋白表达,EMSA法测定结肠组织NF-κB活性。
结果：雷公藤甲素能明显减少成年IL-10-/-小鼠临床评分、减轻肠道炎症损伤,停药后可维持至少3周时间。雷公藤甲素治疗可明显降低成年IL-10-/-小鼠肠道IL-4(101.993±7.176 vs60.417±8.424,**p＜0.01)及TLR4蛋白表达水平,并抑制结肠组织NF-κB活性。
结论：雷公藤甲素对成年IL-10-/-小鼠已确定肠炎具有一定的治疗效果。雷公藤甲素对诱导CD缓解,可能有一定疗效,且针对CD患者肠粘膜免疫类型的转换,雷公藤甲素也有着较好的适应性。