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目的:本实验在成功复制出人脐静脉平滑肌细胞(human umbilical vein smooth muscle cells, HUSMCs)钙化模型的基础上,观察血管紧张素-(1-7)[Angiotensin-(1-7), Ang-(1-7)]对HUSMCs钙沉积的影响,探索Ang-(1-7)延缓或抑制HUSMCs钙沉积的可能机制。方法:1. HUSMCs钙化模型的复制采用不同浓度β-甘油磷酸盐(β-GP)刺激体外培养的HUSMCs,分为5组(n=6):对照组(CON),终浓度为10mmol/L、12mmol/L、14mmol/L、16mmol/L的β-甘油磷酸盐组(即10mmol/L组、12mmol/L组、14mmol/L组、16mmol/L组)。采用Von Kossa染色观察HUSMCs钙沉积情况,显微图像分析Von Kossa染色钙化细胞百分比,磷酸苯二钠法测定细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性,甲基百里香酚蓝法测定各组细胞中钙含量,探寻β-GP复制HUSMCs钙化模型的最佳浓度。2.血管紧张素-(1-7)对HUSMCs钙化的影响2.1.在成功复制HUSMCs钙化模型基础上,给予血管紧张素-(1-7)进行干预,分为6组(n=6):对照组(CON)、钙化组(CAL)、单纯血管紧张素-(1-7)组[Ang-(1-7)组]、钙化+血管紧张素-(1-7)高剂量组[Ang-(1-7) H组]、钙化+血管紧张素-(1-7)中剂量组[Ang-(1-7)M组]、钙化+血管紧张素-(1-7)低剂量组[Ang-(1-7) L组]。2.2.检测方法①对细胞Von Kossa染色、显微图像分析、ALP活性和细胞钙含量等指标进行检测,观察各组细胞钙沉积情况。②酶联免疫吸附法检测细胞培养液中TGFβ1活性。③Western blot法检测HUSMCs中核心结合因子1(core binding factorα1,Cbfα1)蛋白表达。④放射免疫技术检测培养液中骨钙素(OC)含量,观察HUSMCs骨钙素变化。结果:1. HUSMCs钙化模型复制不同浓度β-GP诱导体外HUSMCs钙化,Von Kossa染色结果显示12mmol/L组大量HUSMCs呈菊花状聚集生长,细胞聚集处可见棕褐色钙结节,显微图像分析系统定量计算结果发现12mmol/L组与CON组、10mmol/L组、14mmol/L组、16mmol/L组相比,钙化细胞百分比明显增加,细胞钙含量和ALP活性均显著升高,有显著性差异。2.血管紧张素-(1-7)对HUSMCs钙化影响①Ang-(1-7)可明显减少HUSMCs聚集生长,Von Kossa染色显示细胞聚集处棕褐色钙结节较CAL组明显减轻(P<0.01),Ang-(1-7)高、中、低剂量组钙化细胞百分比、细胞钙含量和ALP活性较CAL组明显降低(均为P<0.01)。②Ang-(1-7)高、中、低剂量组与CAL组相比细胞TGFβ1水平、cbfα1表达、骨钙素含量均降低(分别P<0.01)。结论:1.12mmol/Lβ-GP刺激HUSMCs10天,可成功复制体外HUSMCs钙沉积模型。2.采用显微图像分析系统可定量计算出Von Kossa染色钙沉积情况,可作为鉴定Von Kossa染色钙化的辅助方法。。3、Ang-(1-7)可以减轻HUSMCs钙化程度。4、Ang-(1-7)通过影响TGFβ1-Smads-Cbfα1信号通路级联效应,减弱信号通路中关键信号分子TGFβ1、Cbfα1表达,发挥延缓HUSMCs钙化的作用。