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目的：端粒酶催化亚单位（TERT）分子是肿瘤细胞在发生恶性转化过程中起重要作用的分子，在不同类型的肿瘤组织中广泛表达，而人体正常组织中通常不表达。因此，将TERT作为“通用肿瘤抗原”的肿瘤免疫治疗策略是很有前景的一种免疫治疗方法。本实验将hTERT的多个CD4+及CD8+T细胞表位串联连接，连接到真核和原核表达质粒中，制备DNA疫苗和多表位肽疫苗（mutiple-epitope peptide of hTERT，以下简称meTERT），并用其免疫小鼠，对其免疫原性进行初步研究。
方法：
1.采用重叠延伸PCR技术将hTERT的CD4+和CD8+T细胞表位串联连接，得meTERT的DNA片段。
2.将上述DNA片段连接到真核重组表达载体pcDNA3.1中，制备重组质粒pcDNA3.1-meTERT，并进行PCR、双酶切及测序鉴定；将pcDNA3.1-meTERT质粒转染COS-7细胞进行瞬时表达，Western-blot检测meTERT多肽的表达。
3.构建多表位肽的原核重组表达质粒pGEX-meTERT，PCR、酶切鉴定后将pGEX-meTERT转化至表达宿主菌E.coli BL21，Western-blot检测GST-meTERT蛋白的表达；亲和层析纯化重组蛋白GST-meTERT。
4.雌性BALB/c小鼠随机分为5组，每组6只，每10天免疫一次，共免疫4次，分组：①PBS对照组：注射无菌PBS；②PC空组：注射空载体；③PCT组：注射pcDNA3.1-meTERT DNA疫苗；④PG组：注射GST-meTERT蛋白疫苗；⑤PCT-PG组：初次免疫pcDNA3.1-meTERT DNA疫苗，加强免疫用GST-meTERT蛋白疫苗，即prime-boost免疫法。小鼠眼眶内眦静脉取血，进行间接ELISA抗体滴度检测；末次免疫后14天，处死小鼠，分离脾细胞作为效应细胞，ELISPOT方法检测IFN-γ、IL-4水平；LDH方法检测特异性CTL杀伤率；流式细胞术检测CD4+T和CD8+T细胞。
结果：
1.成功构建了多表位肽的真核重组表达质粒pcDNA3.1-meTERT，经PCR、酶切及测序鉴定与预期目标一致。将真核质粒转染COS-7细胞，Western-blot检测表明meTERT多肽在细胞内可以成功表达。
2.成功构建了多表位肽的原核重组表达质粒pGEX-meTERT，PCR和酶切鉴定结果与预期目标一致。将质粒转化至表达宿主菌E.coli BL21中，Western-blot鉴定结果亦表明融合蛋白GST-meTERT成功表达。将融合蛋白GST-meTERT亲和层析纯化，得到可用于免疫小鼠的纯品GST-meTERT融合蛋白。
3.小鼠血清特异性抗体水平
将上述获得的多表位肽真核表达质粒和/或GST-meTERT融合蛋白免疫小鼠后，小鼠产生特异性IgG抗体，与PBS组比较，PC空、PCT、PG、PCT+PG组抗体水平均显著上升（P<0.01）。PCT+PG组与PCT或PG组比较抗体水平亦明显上升（P<0.01）。
4.ELISPOT检测免疫小鼠脾脏分泌IL-4和IFN-γ的淋巴细胞的水平
各组免疫小鼠脾细胞在体外用特异性抗原刺激后，其激活的分泌IL-4和IFN-γ的淋巴细胞数均明显上升，与PBS组比较，PC空、PCT、PG、PCT+PG组分泌IL-4和IFN-γ的淋巴细胞数明显增加（P<0.01），PCT+PG组与PCT或PG组比较分泌IL-4和IFN-γ的淋巴细胞数亦明显增加（P<0.01）。
5.小鼠脾细胞特异性CTL杀伤活性
与PBS组比较，PC空、PCT、PG、PCT+PG组所诱导的CTL水平明显升高（P<0.01），PCT+PG组与PCT或PG组比较CTL水平亦明显升高（P<0.01）。
6.流式细胞仪检测CD4+T和CD8+T细胞
与PBS组比较，PCT、PG、PCT+PG组CD4+T和CD8+T细胞的百分率明显升高（P<0.01），PCT+PG组的CD4+T和CD8+T细胞的百分率显著高于PCT或PG组（P<0.01）。
结论：本实验将hTERT的多个CD4+及CD8+T细胞表位串联连接，构建真核表达质粒pcDNA3.1-meTERT和原核表达质粒pGEX-GST-meTERT，并进行了融合蛋白GST-meTERT的表达和纯化，成功制备了meTERT的DNA疫苗和蛋白疫苗；动物实验表明：meTERT DNA疫苗和蛋白疫苗均能诱导强烈的细胞免疫和体液免疫应答，且PCT-PG组，即prime-boost法免疫组优于PCT和PG单独免疫细。