【摘 要】
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鲫造血器官坏死症、锦鲤疱疹病毒病、草鱼出血病是目前在我国养殖大宗淡水鱼中造成严重危害的三种病毒性疾病,其病原分别是鲤疱疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）、锦鲤疱疹病毒（KHV）以及草鱼呼肠孤病毒（GCRV）。本文建立了的CyHV-2、KHV、GCRV实时荧光重组酶聚合酶扩增（RPA）快检方法,为水产食品原料安全生产控制提供理论与技术上的支持。主要研究结果如下:1.首先筛选出CyHV-2的保守基因片段,根据
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鲫造血器官坏死症、锦鲤疱疹病毒病、草鱼出血病是目前在我国养殖大宗淡水鱼中造成严重危害的三种病毒性疾病,其病原分别是鲤疱疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）、锦鲤疱疹病毒（KHV）以及草鱼呼肠孤病毒（GCRV）。本文建立了的CyHV-2、KHV、GCRV实时荧光重组酶聚合酶扩增（RPA）快检方法,为水产食品原料安全生产控制提供理论与技术上的支持。主要研究结果如下:1.首先筛选出CyHV-2的保守基因片段,根据其设计出RPA引物探针,并合成重组质粒,优化反应条件,确定RPA方法的灵敏度和特异性,同时引用文献中的qPCR方法同时做灵敏度特异性进行检测,与本研究RPA方法做对比分析,最后进行实际样品的检测。结果显示:本研究建立的CyHV-2-RPA检测方法,搭配便携式PCR仪作为实时监控进行实时荧光RPA反应,能在39℃恒温条件下,10 min内最低能检测到10~3 copies/μL的病毒DNA,经验证此方法具有良好特异性;2.根据KHV的Sph基因片段设计RPA引物探针,并合成重组质粒,优化反应条件,确定RPA法的灵敏度和特异性,引用文献中的qPCR方法同时做灵敏度特异性进行检测,与本研究RPA方法做对比分析。结果显示:本研究建立的KHV-RPA检测方法,搭配便携式PCR仪作为实时监控进行实时荧光RPA反应,方法能在39℃恒温条件下,对KHV病毒DNA进行特异性扩增,10 min内最低能检测到10~3copies/μL的病毒DNA;3.根据GCRV的保守基因片段设计RPA引物探针,并合成重组质粒,优化反应条件,确定RPA法的灵敏度和特异性,引用文献中的qPCR方法同时做灵敏度特异性进行检测,与本研究RPA方法做对比分析。结果显示:本研究建立的GCRV-RPA检测方法,搭配便携式PCR仪作为实时监控进行实时荧光RPA反应,在40℃恒温条件下,在10 min内最低能检测到10~2copies/μL的病毒核酸,且方法特异性良好。4.本研究建立了的病毒DNA磁珠快提法,并优化了提取条件及提取试剂。结果显示:病毒DNA磁珠快提法可以在15 min内完成病毒DNA的提取,和实时荧光RPA相结合,最快可在40 min内完成从样品处理到核酸扩增检测的全过程。
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