论文部分内容阅读
原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)在全世界范围内是高发的恶性肿瘤之一,尤其在我国肝癌是处于第二位因肿瘤导致死亡的疾病,每年有超过400,000的死亡病例。而且在过去的近10年中肝癌的发病率还在持续增加当中,因此开展肝癌相关致病基因的研究具有重要的现实意义。
在本实验室先前的系列研究中,报道了一个新的肝癌相关基因,被命名为fupl(function-unknown proteinl),其编码区全长为1233bp,包括3个外显子,其蛋白产物的分子量约为46kDa,等电点为5.55,细胞定位预测其很可能是一个核蛋白。先前的研究表明fup1基因在人类除了心脏和骨骼肌以外的大多数正常组织中只有少量的表达。在正常的肝组织中也只有少量的表达,但是在人肝癌细胞株中FUP1广泛表达。实验证实FUP1能够促进NIH3T3细胞的增殖,进一步实验证明FUP1具有促进肝癌细胞在裸鼠体内成瘤性的作用。
通过对FUP1全长蛋白序列的抗原性预测分析,本研究发现其抗原簇富集于C段----FUP1C(901bp-1233bp,全长为390bp,其表达片段产物分子量约为14.56kDa,等电点为6.31),为此通过对FUP1C全长序列进行了大肠杆菌偏爱密码子的优化,构建了FUP1C大肠杆菌高效表达质粒:经过诱导表达并且多次纯化获得了高纯度的FUP1C片段,以此作为抗原注射到兔子体内,诱导相应的抗体产生;用ELISA和Western-Blot来检测anti-FUP1C抗体,证实了其具有高活性,高灵敏度以及相对特异性。
化学合成的siRNA,以及相对应的阳性和阴性对照siRNA被高效转染到人肝癌细胞系BEL7404和人正常肝细胞系L02中。Western-Blot实验结果表明,经过RNAi有效的干扰作用,BEL7404中的FUP1蛋白表达水平显著地下降,并且肝癌细胞的生长增殖受到明显地抑制;而同样的RNAi干扰实验在人正常肝细胞系L02中,FUP1蛋白表达水平无显著变化且L02细胞生长增殖没有受到明显地抑制。根据以上结果分析,进一步证实了FUP1在肝癌中高表达,并且对肝癌的生长起到重要作用。
构建了全长FUP1表达质粒,并且在Codon-plus的大肠杆菌BL21-CodonPlus-RIL中实现了高表达,同时收集处理等量的人肝癌细胞BEL7404和人正常肝细胞L02的总蛋白,以anti-FUP1C为抗体做Western-Blot反应,结果证实了在肝癌中FUP1蛋白的表达明显地高于正常肝组织中。
通过高通量的肝癌组织芯片,用anti-FUP1C抗体检测了来自于临床手术切除的153例肝细胞癌患者的组织以及75例非癌肝组织,通过免疫组织化学来检测FUP1在不同组织中的表达差异。
实验结果表明,在细胞核中FUP1的表达肝癌明显高于癌旁和非癌(P<0.01);而在细胞浆中FUP1的表达,肝癌明显低于癌旁和非癌(P<0.05)。在不同分化的肝癌中,FUP1的表达在胞浆中具有显著性差异,随着肿瘤级别增加FUP1表达反向下降(P<0.05);而在细胞核中FUP1都呈高表达,但无显著性差异(P>0.05)。
根据以上结果分析,可以初步证明fup1基因在肝癌细胞核中高表达,并且随着肿瘤发生发展,不断地在细胞核中累积;而在肝癌发生的早期,FUP1在癌旁和非癌肝组织的胞浆中大量合成,随着肝癌发生发展其通过入核,对肝癌生长起到重要的作用。以此推断FUP1其重要的功能是依赖于在核内起作用的。
根据GenBank(Access No.:NM_018167)数据库的查询与分析,FUP1又名BTBD7(BTB/POZ domain containing 7)是BTB家族的一员;而BTB家族中如:PLZF和BCL-6被证实作为转录因子在白血病的发生发展中扮演重要角色。为此本研究推测FUP1可能是一种转录因子在细胞核内通过调节相关核基因的表达而促进肝癌的发生发展。FUP1具有作为肝癌一种新诊断和治疗靶蛋白的潜在可能。