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慢性特发性血小板减少性紫癜(Chronic idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)是以免疫介导的血小板破坏过多为特征的一种出血性疾病。临床上以粘膜出血,病程长,反复发作为特点。50%~60%的患者体内可检测到一种或几种针对血小板糖蛋白的自身抗体,其中约75%的抗血小板自身抗体是针对血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa和Ⅰb/Ⅸ的,该抗体与血小板膜表面糖蛋白结合,随后致敏的血小板通过Fc受体被巨噬细胞吞噬或因补体活化而破坏。然而迄今为止,ITP的治疗仍以非特异性免疫抑制疗法为主,还未出现针对血小板反应性T细胞或B细胞的抗原特异性免疫抑制疗法。B细胞产生自身抗体需要自身抗原特异性T细胞的参与。研究表明ITP患者在T细胞亚群及功能等很多方面都可发现异常。更有大量实验证实,在ITP患者外周血中存在针对GPⅡb/Ⅲa等血小板膜蛋白的自身反应性CD4+T细胞。自身反应性T细胞识别血小板抗原特定表位,进而活化,分泌细胞因子,并与相应B细胞直接作用,激活B细胞,B细胞增殖分化为浆细胞,导致自身抗体的产生。因此,诱导GP反应性CD4+T细胞免疫失活将有可能为慢性ITP靶向性治疗提供新的思路。第一部分CTLA4-Ig诱导的无能T细胞在慢性ITP中的免疫调节作用目的;T淋巴细胞活化增殖并引起免疫应答需要双信号刺激;细胞受体(TCR或BCR)与抗原结合所提供的活化起始信号,即第一信号;细胞表面辅助分子与相应配体结合所提供的协同共刺激信号,即第二信号。两个信号缺一不可,如果缺失第一信号或传递受阻则免疫反应无法进行;如果缺失第二信号或传递受阻,则会导致T细胞对供体抗原的特异性免疫耐受状态,即T细胞无能。可见共刺激信号启动、维持并调节活化级联反应,为细胞抗原特异性激活所必需,决定了细胞是活化增殖、抑或转变为无能状态(anergy)甚至凋亡(apoptosis)。T细胞无能是确保机体T细胞产生抗原特异性耐受的主要机制之一,它的无反应状态不是被动的,而是具有主动的抑制效应。许多研究发现,无能T细胞可以主动抑制具有相同抗原特异性的其它效应性T细胞的增殖,并通过细胞—细胞接触抑制与之具有相同抗原特异性的T淋巴细胞的增殖,进而诱导反应性T细胞对特异性抗原的耐受,产生传染性耐受(infectious tolerance)或称连锁性抑制(linked suppression)效应。已有大量动物实验通过诱导无能T细胞能延长骨髓移植患者的存活时间,抑制变态反应性脑脊髓炎(EAE)的慢性复发过程、抑制重症肌无力的发生、减轻系统性红斑狼疮的症状。本课题通过诱导血小板糖蛋白(GP)特异性无能T细胞,诱导GP反应性T细胞耐受。并研究GP特异性无能T细胞的作用机制。方法;*制备人GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ抗原;*分离采集外周血单个核细胞(PBMC);*GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ反应性T细胞系的建立;*利用CTLA4-Ig诱导GP特异性无能T细胞;*人外周血树突状细胞(DC)的体外诱导及鉴定;*树突状细胞T细胞活化能力的检测;*无能T细胞抑制实验;①无能T细胞抑制效应检测;②细胞因子阻断实验;③无能T细胞抗原特异性实验。*ELISA方法检测培养体系中IL-10和TGF-β1水平;*Transwell实验;*无能T细胞对B细胞抗体产生的抑制作用。*统计学分析结果;1 ITP患者成熟树突状细胞T细胞活化能力显著高于健康者(P<0.05);不成熟树突状细胞的T细胞活化能力与健康者没有显著差别。2 ITP患者CTLA4-Ig诱导的GP特异性无能T细胞在体外实验中能显著抑制自体GP反应性T细胞的增殖。此抗原特异性抑制效应依赖于抗原递呈细胞的存在。3 CTLA-Ig诱导的GP特异性无能T细胞不依赖于抑制性细胞因子IL-10和TGF-β1发挥抑制效应,细胞—细胞接触是无能T细胞发挥作用的必备条件。其抑制效应并非组成性的,需要特异性抗原的刺激。4 CTLA4-Ig诱导的GP特异性无能T细胞抑制了ITP患者自体树突状细胞的T细胞活化能力,使DC细胞获得了致耐受性。5 CTLA4-Ig诱导的GP特异性无能T细胞可以显著抑制ITP患者自体B细胞分泌抗血小板抗体。结论;CTLA4-Ig诱导的GP特异性无能T细胞通过抑制抗原递呈细胞,如树突状细胞的T细胞活化能力,抑制ITP患者GP反应性T细胞活化增殖,特异性抑制B细胞分泌抗血小板抗体。第二部分由CD4+CD25-T细胞诱导的血小板糖蛋白特异性CD4+CD25+调节性T细胞在慢性ITP中的免疫调节作用目的;CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)是不同于Th1和Th2的具有免疫调节功能的T细胞群体。自然产生(naturally occurring)的CD4+CD25+Treg细胞可以非抗原特异性的抑制T细胞活化和增殖。但是抗原特异性的Treg则可以产生抗原特异性的免疫抑制作用。研究发现,ITP发病时自然产生的CD4+CD25+Treg细胞明显减少,CD4+CD25+Treg细胞在ITP发病中可能起重要作用。因此,本课题拟由ITP患者外周血CD4+CD25-T细胞诱导GP特异性CD4+CD25+调节性T细胞,并研究其诱导免疫耐受的效果和作用机制。方法;*制备人GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ抗原;*分离采集外周血单个核细胞(PBMC);*GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ反应性T细胞系的建立;*人外周血树突状细胞(DC)的体外诱导及鉴定;*免疫磁珠法从ITP患者外周血分选CD4+CD25-T细胞;*体外诱导扩增GP特异性CD4+CD25+调节性T细胞;*ELISA方法检测培养体系中IL-10和TGF-β1水平;*Transwell实验;*GP特异性调节性T细胞抑制实验;调节性T细胞抑制效应检测;细胞因子阻断实验;GP特异性Treg抗原特异性实验。*混合淋巴细胞反应,检测GP特异性调节性T细胞作用后树突状细胞T细胞活化能力的改变;*微阵列芯片分析;细胞RNA的提取;对样品RNA进行荧光标记;杂交与清洗;芯片扫描;芯片图像的采集与数据分析;芯片结果的分析*22K Human Genome Array芯片的质量控制*实时荧光定量PCR检测*统计学分析结果;1、由慢性ITP患者外周血CD4+CD25-T细胞可以诱导出GP特异性CD4+CD25+调节T细胞,该调节T细胞可以显著抑制ITP患者GP反应性T细胞的增殖,诱导GP特异性免疫耐受。2、GP特异性调节T细胞发挥免疫抑制效应需要细胞—细胞接触,并且不依赖于抑制性细胞因子如IL-10、TGF-β1。3、GP特异性调节T细胞的免疫抑制效应具有抗原特异性,并且此抑制效应为非组成性的,它需要抗原的不断刺激。4、与GP特异性调节T细胞共同孵育后,ITP患者DCs获得致耐受性,该致耐受性DCs可进一步诱导其他GP反应性T细胞免疫耐受。5、免疫相关基因如TLR8、FasL、TGFBR3、DLL1、JAG2、CD200、TLR8、IL-1β、、MyD88、IFNGR1、IFNGR2、CCL17、CD209、RANK等可能参与了GP特异性调节T细胞诱导免疫耐受的过程。6、TLR、Notch、IFN-γ和TGF-β信号通路可能参与了GP特异性调节T细胞诱导免疫耐受的过程,其中TLR通路的作用可能最为重要。结论;由ITP患者外周血CD4+CD25-T细胞可成功诱导出GP特异性CD4+CD25+调节性T细胞,此GP特异性CD4+CD25+调节性T细胞可以通过调节树突状细胞的T细胞活化能力及TLR、Notch、IFN-γ和TGF-β等信号通路,诱导ITP患者自体树突状细胞获得致耐受性,从而进一步诱导自体GP反应性T细胞无能,诱导GP特异性的免疫耐受。