肠道病毒71型(enterovirus type 71,简称EV71)是手足口病(hand foot andmouth disease,HFMD)的主要病原体,其感染性强且致病率高,可以导致手足口病、无菌性脑膜炎(Asepicmeningitis)、脑炎(Encephalitis)和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病(Poliomyelitis-like paralysis)等多种神经系统疾病。EV71传染性强,常见全家发病,并可造成局部暴发流行。患者以4～5岁以下小儿多见,成人也可患病,但病情多较轻。一年四季均可发病,以5、6月份为多发。潜伏期2～5日。传播途径不仅是粪-口传播,病毒主要通过人群间的密切接触进行传播,人群密集处易发生病毒的流行,幼托机构内的学龄前儿童是感染的高危人群。进入21世纪以来EV71引起的手足口病疫情在我国及世界多个国家和地区多次大规模出现,对人类健康、经济发展和社会稳定造成了严重的危害。　　 EV 71可感染免疫缺陷者、新生儿及幼儿,造成严重后果,甚至威胁生命。由于是EV71引起的手足口病,与柯萨奇A组和B组的一些病毒引起的手足口病在临床上难以区分,而且Cox16爆发往往伴随着EV71的流行,而且EV71可引起的临床症状与其他病毒引起的初期症状极为相似,因此EV 71是所有肠道病毒中最难鉴定的病毒之一。因此早期、快速、准确的诊断对EV71的预防和隔离至关重要。目前常用的实验室诊断方法包括病毒分离培养、免疫学方法、PCR技术等,但分别存在难以早期诊断、敏感度低或假阳性率高等缺陷。随着分子生物学技术的发展,基因芯片技术因其具有高通量性、快速、准确性强等特点,成为新兴的病毒检测技术。本课题研究借助生物信息学技术和探针设计软件,探索对EV71病毒感染的早期、敏感、准确和快速检测的探针设计,为以后打印成适用的基因检测芯片打下基础。　　 基因芯片技术是近年发展起来的一种新型、高效、快速、敏感的核酸分析与检测方法,基因芯片技术因其具有高通量性、快速、准确性强等特点,成为新兴的病毒检测技术。目前国内尚无使用基因芯片对肠道病毒进行检测的相关报道。鉴于肠道病毒引发疾病的早期诊断对后期的疾病防治工作意义重大,可使用基因芯片技术针对并发症较严重之EV 71、Cox A15、Cox A16、Cox B3等多种肠道病毒的特定基因序列所设计出检测芯片快速诊断肠道病毒感染的具体类型,及时制定治疗措施,提高疾病防治水平。因此使用基因芯片技术对肠道病毒进行联合检测的临床应用前景非常广阔。　　 近年来迅速发展的长链寡核苷酸基因芯片技术(60-70 mer OligoMicroarray),为从基因水平高度特异性的检测EV71提供了可能。长链寡核苷酸探针用作基因芯片探针是近年来在基因芯片研究领域出现的一项新技术,生物信息学研究表明,一条长链寡核苷酸即可代表一个基因,同时又具有较高的特异性,因此,长链寡核苷酸探针集传统cDNA和短链寡核苷酸探针的优点于一身,在一定程度上克服了传统探针的缺点,是制作EV71检测芯片最合适的选择。　　 通过生物信息学研究分析基因芯片探针是一种简便,经济的方法,运用生物信息学工具对基因芯片探针进行设计可以大大减少花费时间、提高工作效率。运用生物信息学方法从核酸数据库中取得基因序列,然后通过序列比对分析,找出其特征序列,作为探针设计的参照序列。序列比对分析是生物信息学中最常用的方法,生物信息学中常用的核酸序列搜索比较算法是BLAST。各种亚型的基因组序列存在碱基插入、缺失和替换而导致的细微差别。利用多重序列比较可以发现基因序列中相对保守的区域,因此可以选择这段保守区作为芯片设计的参考序列。用生物信息学探针设计软件分析保守序列即可获得特异探针。　　 本研究首先确立了长链寡核苷酸基因芯片实验的基本条件,以保证各种参数尽量控制在最佳范围,以保证在同一张芯片上的探针在相同的杂交、清洗条件下得到最佳的杂交效果,并确定了用于寡核苷酸芯片杂交检测所需要的最佳探针片段长度。长链寡核苷酸探针序列长度一般在60-170 mer,60mer的探针尽管合成成本较低,但特异性及固定率均不如70 mer长度的探针:由于70 mer的寡核苷酸芯片能兼顾杂交的特异性和信号强度,已经被越来越多的实验室所接受。　　 本研究首先登录NCBI(National Center for Biotechnology Information)网站GenBank数据库通过搜索获得最新的EV71基因组全长序列,然后将病毒的基因组全长序列使用NCBI的在线BLAST(Basic local alignment search tool)功能进行BLAST比对分析,结果获得EV71的保守序列及型特异性序列,作为设计Oligo探针的备选序列。　　 利用生物学软件Oligo 6.71分别对BLAST检索所得病毒的种属保守序列和型特异性序列逐一进行分析,设计长度均一的70 mer的Oligo探针,并对其进行BLAST比对,为减少非特异性杂交,保证芯片杂交的敏感度和精确度,采用了严格的遴选标准,从中筛选出特异性较高的12条探针,作为制备EV71寡核苷酸检测基因芯片的首选探针序列。本研究使用生物信息学方法对EV71的基因序列进行比对,得到有意义的特异序列；用生物学软件Oligo 6.71为基因芯片设计特异性高、Tm值相近、长度均一的Oligo探针,为基因芯片在临床诊断中的应用作出了贡献。　　 本课题通过实验室研究,得到的实验结果如下:　　 1、使用基因芯片技术对EV71进行诊断,其主要优点是可以同时检测多段基因,而且具有较高的灵敏度。同时,由于分子杂交本身即具有较高的严谨性,应用多组探针联合判断检测结果,也可以有效的降低检测的假阳性率。此外,因基因芯片本身具备高通量大规模的特点,将基因芯片用于鉴别诊断最有优势,可以将多种与EV71早期症状类似的病毒如柯萨奇、疱疹病毒、埃可病毒、轮状病毒等常见病原体点样到芯片上进行联合诊断,对于确诊病人、排除疑似患者具有重要意义。设计出能与靶分子特异结合的探针是准确检测病毒基因的关键。用于病原体检测或诊断的寡核苷酸探针可针对病原体基因的保守序列或是与疾病相关的特异基因来进行设计。长链寡核苷酸探针序列长度一般在60-70 mer,60mer的探针尽管合成成本较低,但特异性及固定率均不如70 mer长度的探针；由于70 mer的寡核苷酸芯片能兼顾杂交的特异性和信号强度,在本研究中我们采用了70 mer的探针序列。　　 2、本研究首先直接通过生物信息学软件从网上GenBank等数据库调取目标序列,然后构建分析项目,再分别对各基因的基因序列进行全长比对,通过比对后再进行探针设计就能避免探针的交叉同源性。在进行探针设计时可据比对结果剔除同源性高的区段,低的区段再行二次甚至三次比对,并选择再次比对结果中相似性分选择再次比对结果中相似性分数值<40的区段作为特异性序列。这些特异性序列和GenBank国际数据库系统中其他现有全部序列的同源性最低,可大大减少非特异性杂交,提高检测的精确度及BLAST分析的效率。　　 3、在用Oligo 6.71对探针进行设计时,选择70 mer长度均一的Oligo作为探针可使杂交条件趋向均一,灵敏度增高。对备选探针进行筛选时,各种参数尽量控制在最佳范围,以保证同一张芯片上的探针在相同的杂交、清洗条件下得到最佳的杂交效果。探针最稳定二级结构的配对碱基长度小于6 bp,G趋于0或为正值,保证探针内部不会形成稳定的二级结构而影响探针与芯片杂交的效率。本研究利用NCBI网站中的GenBank数据库的BLAST功能及生物学软件Oligo 6.71成功设计特异性高、长度一致、融解温度相近的Oligo探针12条,为后期合成基因芯片,用于EV71的检测打下了基础,可以较好的用于进一步的芯片实验阶段。　　 综上所述,基因芯片具有大规模、高通量、高度敏感与高度特异性等特点,在感染性疾病病原体的确定以及进一步的鉴别诊断等方面具有广阔的应用前景。利用NCBI网站中的GenBank数据库的BLAST功能和生物学软件Oligo 6.71设计EV71基因诊断芯片探针,是一种简便可行、有效的方法,为后期合成基因芯片,用于EV71的检测打下了基础,可以较好的用于进一步的芯片实验阶段。