研究背景类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）隶属于中医“痹证”范畴,其中寒证和热证为RA的两种常见中医证型。白虎加桂枝汤是治疗RA热证的代表方剂,临床上治疗风湿热痹具有满意的疗效,主要用于早期或病情活动阶段。然而,现阶段白虎加桂枝汤缓解RA热证的药效物质基础及其作用机理尚不明确,严重阻碍了白虎加桂枝汤在临床中的广泛应用。因此,本研究旨在鉴定白虎加桂枝汤缓解RA热证的药效物质,进而揭示其作用原理。研究目的本研究通过转录组表达谱和网络药理学分析,采用药物入血检测、靶标预测、网络分析、分子对接虚拟筛选、表面等离子共振（surface plasmon resonance,SPR）/微量热泳动（microscale thermophoresis,MST）验证及药代动力学检测的整合研究策略,并与体内外实验验证相结合,筛选白虎加桂枝汤缓解RA热证的代表性药效物质,并探究其潜在机制。研究方法1.利用RA病证结合大鼠模型考察寒、热痹证的生物学内涵及白虎加桂枝汤干预后的药效学差异及潜在机制1.1 RA疾病模型的建立1.1.1 单纯RA模型:100mg灭活结核杆菌M tuberculosis H37 Ra溶入10mL液体石蜡中配置为混悬液（浓度:10mg/mL）,雄性Lewis大鼠尾部皮下注射0.1mL配置好的10mg/mL的造模剂,诱导佐剂诱导型关节炎（adjuvant-induced arthritis,AIA）大鼠模型1.1.2 RA病证结合大鼠模型:在复制AIA模型的同时,模拟RA致病因素,分别施加外界风湿热（风速6m/s,相对湿度均为90%,温度为37℃）、风寒湿（风速6m/s,相对湿度均为60%,温度为6℃）条件,连续15天刺激,造成AIA热证和AIA寒证模型。1.2动物分组与给药69只雄性Lewis大鼠随机分为7组:空白对照组（Control,n=15）、AIA-热证模型组（AIA-H,n=15）、AIA-寒证模型组（AIA-C,n=15）、AIA-热证+白虎加桂枝汤组（AIA-H+BHGZD,21.4g/kg,2倍临床等效剂量,前期结果表明药效最优剂量,n=15）、AIA-热证+甲氨蝶呤组（AIA-H+MTX,0.2mg/kg,临床等效剂量,n=3）、AIA-寒证+白虎加桂枝汤组（AIA-C+BHGZD,21.4g/kg,2倍临床等效剂量,前期结果表明药效最优剂量,n=3）、AIA-寒证+MTX组（AIA-C+MTX,0.2mg/kg,临床等效剂量,n=3）。大鼠给药按照1mL/100g体重灌胃,自免疫当天灌胃给药,正常对照组和模型组灌服等量水。给药至免疫第30天取材。1.3关节炎评价1.3.1 疾病严重指标评价:观察并记录各组大鼠疾病严重程度,采用关节炎临床积分、关节肿胀度、体重、胸腺指数、脾脏指数及疼痛阈值综合评价;并采用肝脏指数及肾脏指数对肝肾毒性进行评价。1.3.2 病证特征指标评价:观察并记录各组大鼠病证特征指标,采用关节表面温度评价。1.4转录组表达谱分析1.4.1 全基因组表达谱芯片检测委托上海伯豪生物技术有限公司（Shanghai Biotechnology Corporation）采用全基因表达谱芯片（Agilent Whole Rat Genome Microarray 4×44K,Design ID 014879）对滑膜组织样本进行检测。原始数据用软件R软件中limma包归一化后,采用Fold Change（FC,表达差异倍数）以及T检验（Student’s t-test）统计学方法对差异基因进行筛选,挑选条件为 FC（linear）≤0.5 或 FC（linear）≥2;T-test p-value＜0.05。1.4.2mRNA-seq转录组测序委托北京致美伊诺生物科技有限公司（Beijing,China）采用mRNA-seq转录组测序对外周血细胞样本进行检测。按照| log2FC|＞1且padj＜0.05标准进行差异表达分析与筛选。1.5网络构建与分析1.5.1 白虎加桂枝汤效应基因-RA热证候选靶标相互作用网络的建立:基于String数据库（Version 11.5,https://cn.string-db.org/）,提取白虎加桂枝汤候选靶标分子与RA热证候选靶标基因的相互作用信息,并构建药物靶标分子网络[21]。采用Navigator software（Version 2.3.0,http://ophid.utoronto.ca/navigator/）及 Cytoscape（Version 3.9.0,https://cytoscape.org/）进行网络可视化。1.5.2 网络拓扑特征值计算:通过上述“药物靶标-疾病基因”互作网络中网络节点拓扑特征值:节点连接度（Degree）、节点介度（Betweenness Centrality）、节点紧密度（Closeness Centrality）,选取拓扑特征值均大于相应中位数的节点,为白虎加桂枝汤干预RA热证相关失衡网络的关键候选靶标,进行通路富集分析。1.6白虎加桂枝汤对各组大鼠体内预测信号通路相关分子表达的影响采用western blotting检测检测各组大鼠膝关节中TLR4（toll-like receptor 4）、p-PI3K（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase）/PI3K、p-AKT1/AKT1（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase）、p-NF κ B/NF κ B（nuclear factor kappa-B）、NLRP3（NOD-like receptor protein 3）、ASC（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD）、caspase-1、GSDMD-NT（the N-terminal domain of gasdermin D）及IL-1 β（interleukin-1 beta）候选靶标蛋白表达;并运用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELASA）检测各组大鼠血清中 TLR4、IL-1 β 和 IL-18 蛋白表达,以及 caspase-1 和 LDH（lactate dehydrogenase）活性。1.7白虎加桂枝汤抗体外细胞焦亡及机制验证1.7.1 细胞培养:Raw264.7小鼠巨噬细胞,实验用4～8代细胞,按照常规培养于完全培养基中[基础培养基（dulbecco’s modified eagle medium,DMEM/HIGH GLUCOSE）、10%胎牛血清（fetal calf serum,FBS）和 1%双抗（penicillin-streptomycin,PS）],于 37℃/5%C02,饱和湿度培养箱内孵育;MH7A关节炎滑膜成纤维细胞,实验用4～8代细胞,按照常规培养于完全培养基中[滑膜细胞培养基（synoviocyte growth medium）、10%FBS和1%PS],于37℃/5%C02,饱和湿度培养箱内孵育。1.7.2 细胞诱导与分组给药（1）细胞诱导:Raw264.7细胞采用0.2μg/mL LPS单独诱导4h,接着采用3mM ATP诱导1h,于37℃/5%C02,饱和湿度培养箱内孵育;MH7A细胞采用1μg/mL LPS单独诱导6h,接着采用3mM ATP诱导1h,于37℃/5%C02,饱和湿度培养箱内孵育。（2）分组给药:正常对照组（正常细胞培养,无诱导,无给药）、LPS/ATP诱导组（细胞用相应浓度LPS及ATP诱导,无给药）、白虎加桂枝汤给药组（分别采用7.14、14.28及28.54μg/mL的白虎加桂枝汤预给药24h后,采用相应浓度LPS及ATP诱导）及MCC950抑制剂组（细胞用相应浓度LPS诱导后,100nM MCC950给药30min后加入3mM ATP）。1.7.3 细胞增殖实验:采用 Cell-Counting-Kit-8（CCK-8）检测 1、5、25、125、250、500、625、1250及2500μg/mL剂量白虎加桂枝汤对Raw264.7及MH7A细胞活力的影响。1.7.4 细胞焦亡程度检测:采用流式细胞术、TUNEL细胞凋亡染色（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP biotin nick end labeling,TUNEL 染色）及采用FAM-FLICA? caspase-1综合评价Raw264.7及MH7A细胞焦亡情况。1.7.5 白虎加桂枝汤对Raw264.7及MH7A细胞体外预测信号通路相关分子表达的影响采用 western blotting 检测检测各组细胞中 TLR4、p-PI3K/PI3K、p-AKT1/AKT1、p-NF κ B/NF κB、NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD-NT 及 IL-1 β 候选靶标蛋白表达;并运用 ELASA检测各组细胞上清中LDH释放量及IL-1 β和IL-18蛋白表达;采用免疫荧光技术（immunofluorescence technique）检测细胞中 TLR4、NLRP3 及 ASC 蛋白表达。2.白虎加桂枝汤缓解RA热证发挥抗炎和免疫调节的代表性药效物质辨识研究2.1白虎加桂枝汤入血成分检测2.1.1 动物给药与取材:12只Lewis雄性大鼠随机分为2组,每组6只（空白对照组及白虎加桂枝汤给药组）。禁食12h后,白虎加桂枝汤单次剂量灌胃,给药剂量为21.4g/kg,空白对照组给予等量生理盐水;分别于给药后不同时间点（0、0.5、1、2、4、6、8、12及24h）眼底静脉丛采血（～250μL）,冰上静置1h,12000rpm离心15min,取上层清液,用于不同时间点定量检测;取给药2h后的血清用于白虎加桂枝汤入血成分定性检测。2.1.2 供试品溶液制备:吸取100μL血清样品,置于1.5mL EP管中,加入200μL预冷乙腈（含50ng/mL D4-naringin,内标）沉淀蛋白,涡旋振荡2min,在4℃下12000r/min离心20min,收集上清液,即得血清供试品,分别用于定性和定量分析。2.1.3 分析方法的建立:采用超快速高效液相色谱（UFLC XR,Shimadzu Corp.,Japan）串联四级飞行时间质谱仪（Triple TOFTM 5600+,AB Sciex,Forster City,USA）对白虎加桂枝汤中入血成分进行鉴定。2.2分子对接虚拟筛选2.2.1 白虎加桂枝汤候选靶标蛋白与小分子活性成分结构收集（1）白虎加桂枝汤干预RA热证“免疫-炎症”失衡网络的关键候选靶标蛋白结构收集:从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）中获取相关靶标的三维结构及活性口袋信息。选择存在靶标与小分子的复合物晶体结构,将复合物晶体结构中的小分子所在位置定义为对接活性口袋;或对靶标进行表面口袋定位,挑选最大的口袋进行对接分析;（2）白虎加桂枝汤缓解RA热证的小分子活性成分结构收集:采用UFLC-Q-TOF-MS/MS检测获得白虎加桂枝汤入血成分,进行药物ADME特性评估,筛选出具有生物活性的化学成分,使用ZINC数据库（https://zinc.docking.org/）获得以上成分的三维结构;2.2.2 分子对接虚拟筛选分别采用LEDock、Autodock及Autodock Vina三种分子对接软件评估白虎加桂枝汤所含活性成分与网络关键候选靶标间的结合能力。在以上软件分子对接虚拟筛选结果中,对接结合能＜-5.0 kcal/mol表示对接化合物与靶标蛋白之间具有较强亲和力。依据对接结合能,初步筛选白虎加桂枝汤缓解RA热证的关键候选药效物质。2.3 SPR/MST 验证2.3.1 白虎加桂枝汤关键候选药效物质和候选靶标蛋白准备:购买分子对接虚拟筛选获得的具有较强亲和力的关键候选药效物质及候选靶标蛋白。2.3.2 SPR 分析:采用 Biacore 8K（Biacore,Cytiva）检测 AKT1 重组蛋白（ab116412,Abcam,Cambridge,UK）与白虎加桂枝汤中芒果苷（mangiferin,MG）的结合能力。2.3.3 MST 分析:采用 NanoTemper Monolith NT.115 仪器（NanoTemper Technologies,Germany）检测TLR4重组蛋白（ab33665,Abcam,Cambridge,UK）与白虎加桂枝汤中肉桂酸（cinnamic acid,CA）间的结合能力。2.4药代动力学检测2.4.1 动物给药与取材:24只Lewis雄性大鼠,随机分为3组,每组8只。组别如下:空白对照组、白虎加桂枝汤单次剂量给药组及白虎加桂枝汤累积给药组。禁食12h后,白虎加桂枝汤给药组分别单次剂量给药和累积给药13天,给药剂量为21.4g/kg,空白对照组给予等量生理盐水;分别于给药不同时间点（0、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12及24h）眼底静脉丛采血（～250μL）,冰上静置1h,12000rpm离心15min,取上层清液。2.4.2 药代动力学分析:采用超高液相色谱仪串联离子阱四级杆QTRAP 6500-质谱（AB Sciex 6500 QTRAP）联用分析系统检测白虎加桂枝汤给药后不同时间点大鼠血清中候选药效物质的含量,采用非房室模型分析,计算药物半衰期、达峰时间等药代动力学参数。3.白虎加桂枝汤干预RA热证“免疫-炎症”失衡环节的代表性药效物质的药效学评价和相关机制研究3.1 RA疾病模型的建立（同1.1）3.2动物分组与给药45只雄性Lewis大鼠,随机分为9组,每组5只:空白对照组（Control）、单纯AIA模型组（AIA）、AIA-热证模型组（AIA-H）、AIA-寒证模型组（AIA-C）、AIA-热证+白虎加桂枝汤组（AIA-H+BHGZD,21.4g/kg,2倍临床等效剂量,前期结果表明药效最优剂量）、AIA-热证+芒果苷+肉桂酸（AIA-H+MG+CA,600.91mg/kg芒果苷+46.62mg/kg肉桂酸,按照白虎加桂枝汤临床2倍剂量折算各化学成分用量）、AIA-寒证+白虎加桂枝汤组（AIA-C+BHGZD,21.4g/kg,2倍临床等效剂量,前期结果表明药效最优剂量）、AIA-热证+芒果苷+肉桂酸（AIA-H+MG+CA,600.91mg/kg芒果苷+46.62mg/kg肉桂酸,按照白虎加桂枝汤临床2倍剂量折算各化学成分用量）、AIA+MTX组（AIA+MTX,0.2mg/kg,临床等效剂量）。大鼠给药按照1mL/100g体重灌胃,自免疫当天灌胃给药,正常对照组和模型组灌服等量水。给药至免疫第30天取材。3.3关节炎评价3.3.1 疾病严重指标评价观察并记录各组大鼠疾病严重程度,采用关节炎发病率（自免疫开始,观察并记录各组发病大鼠的只数/大鼠总只数）、关节炎临床积分、关节肿胀度、体重、胸腺指数、脾脏指数及疼痛阈值综合评价;并采用肝脏指数及肾脏指数对肝肾毒性进行评价;并采用Micro-CT扫描、苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,H＆E）、番红-O-固绿染色（safranin-O-fast green staining）及 masson 三色染色（masson trichrome staining）观察各组大鼠关节右后肢病理改变。其中关节炎临床积分、关节肿胀度、体重、胸腺指数、脾脏指数及疼痛阈值同1.3.1。3.3.2 病证特征指标评价:观察并记录各组大鼠病证特征指标,采用关节表面温度和每日饮水量（大鼠每日饮水量采用量筒称量）综合评价。3.4 TUNEL染色:采用TUNEL染色对各组大鼠膝关节组织中细胞焦亡情况进行检测。3.5芒果苷和肉桂酸对各组大鼠体内预测信号通路相关分子表达的影响（部分同1.6）采用 western blotting、ELISA 检测（检测各组大鼠血清中 TLR4、IL-1 β、IL-18、TNF-α、IL-6和IL-12蛋白表达,以及caspase-1、GSDMD-NT和LDH活性）;免疫组织化学技术（immunohistochemistry）、免疫荧光检测各组大鼠受累关节中蛋白表达。3.6芒果苷和肉桂酸抗体外细胞焦亡作用3.6.1 细胞培养（同1.7.1）3.6.2 细胞诱导与分组给药（1）细胞诱导[同1.7.2（1）]（2）分组给药:正常对照组（正常细胞培养,无诱导,无给药）、LPS/ATP诱导组（细胞用相应浓度LPS及ATP诱导,无给药）、白虎加桂枝汤给药组（采用28.54μg/mL的白虎加桂枝汤预给药24h后,采用相应浓度LPS及ATP诱导）、芒果苷和肉桂酸组合给药组（MG+CA,按照前期化学成分定量检测结果计算,采用1.69ng/mL芒果苷和0.13ng/mL肉桂酸,按照5μg/mL白虎加桂枝汤折算各化学成分用量,预给药24h后,采用相应浓度LPS及ATP诱导）、芒果苷单独给药组（MG,采用1.69ng/mL芒果苷预给药24h后,采用相应浓度LPS及ATP诱导）、肉桂酸单独给药组（CA,采用0.13ng/mL肉桂酸预给药24h后,采用相应浓度LPS及ATP诱导）。3.6.3 细胞增殖实验:采用CCK-8检测试剂盒检测不同浓度芒果苷（0.21、0.42、0.84、1.69、3.37 及 6.74ng/mL）及肉桂酸（0.02、0.34、0.07、0.13、0.26 及 0.52ng/mL）对Raw264.7细胞活力的影响。3.6.4 细胞焦亡程度检测（同1.7.4）3.7芒果苷和肉桂酸对焦亡细胞中预测信号通路相关分子表达的影响（同1.7.5）研究结果1.白虎加桂枝汤可有效缓解RA寒、热模型大鼠关节炎严重程度,尤其治疗RA热证为佳,其作用机制主要与其调节机体“免疫-炎症”失衡相关1.1从疾病严重程度及病证特征指标,评价白虎加桂枝汤干预RA病证结合大鼠的药效差异1.1.1 白虎加桂枝汤可有效缓解RA热证及RA寒证大鼠关节炎严重程度,尤以治疗RA热证为佳从大鼠关节炎宏观表征来看,AIA、AIA热证及AIA寒证模型大鼠关节明显红肿、畸变,白虎加桂枝汤给药后,可显著改善AIA热证及AIA寒证模型大鼠关节病变程度,降低大鼠关节炎临床积分及后肢肿胀度,改善体重下降（自免疫第12天至给药结束）,尤以对AIA热证模型大鼠的改善作用更为显著,与阳性药MTX作用相当;自免疫第5天起至给药结束,AIA、AIA热证及AIA寒证模型大鼠的机械痛阈值、丙酮刺激冷痛阈值及机械痛阈值均显著降低,在白虎加桂枝汤给药后可显著提高AIA热证及AIA寒证模型大鼠的三种痛阈值（分别自免疫第5、15、15天至给药结束）,表现为减少退缩反应频率、降低冷刺激反应评分并延长反应时间,尤以对AIA热证模型大鼠的改善作用更为显著,与阳性药MTX作用相当;AIA、AIA热证及AIA寒证模型大鼠脾脏及胸腺指数均较正常对照组大鼠高,在白虎加桂枝汤给药后均可降低AIA热证及AIA寒证大鼠脾脏及胸腺指数,尤以对AIA热证模型大鼠的改善作用更为显著,与阳性药MTX作用相当;1.1.2 白虎加桂枝汤可有效缓解RA热证及RA寒证大鼠病证特征指标,尤以治疗RA热证为佳AIA、AIA热证及AIA寒证模型大鼠的关节表面温度较空白对照相比均显著升高,其中AIA热证模型大鼠关节表面温度较单纯AIA模型组高,AIA寒证较单纯AIA模型组较低;白虎加桂枝汤给药后可显著降低AIA热证及AIA寒证模型大鼠的关节表面温度,尤其对AIA热证模型组的改善作用更为显著。1.1.3 白虎加桂枝汤尚未造成肝肾毒性AIA、AIA热证和AIA寒证模型组,及白虎加桂枝汤给药后肝脏及肾脏指数均无显著性差异,表明AIA模型组及白虎加桂枝汤尚未造成肝肾毒性和损伤。1.2从病证差异分子网络,揭示RA热证的生物学基础1.2.1 RA热证发病相关基因收集以FC≥2.0或≤0.5,p＜0.05为差异筛选标准,采用全基因组表达谱芯片检测技术共检测滑膜组织中AIA热证与空白对照组间94个差异表达基因（differential expression genes,DEGs,AIA-H vs.Control）,其中60个上调基因,34个下调基因;采用mRNA-seq转录组测序共检测外周血细胞中AIA热证与空白对照组间390个差异表达基因,其中244个上调基因,146个下调基因。合并两个数据集,将“AIA热证模型组与正常对照组大鼠的组间差异基因集”作为AIA热证发病相关基因,去冗余后共得到474个基因。1.2.2 RA热证相关基因主要参与炎症-免疫调节相关的生物学反应和信号通路AIA热证相关分子主要参与机体炎症反应和免疫调节相关生物学反应,其次参与类风湿关节炎、血液循环、能量代谢与骨破坏等相关通路。1.2.3 RA热证相关基因主要参与机体免疫-炎症调节基于AIA热证相关基因间的相互作用关系,建立AIA热证相关分子网络,该网络包含212个节点和361对相互作用。计算上述网络中212个节点的拓扑特征值,以三个拓扑特征值大于相应中位数为卡值（Betweenness Centrality、Closeness Centrality 及 Degree 的中位数分别为0、0.264910375及2）,共筛选到59个AIA热证相关分子网络的关键hub节点。1.3白虎加桂枝汤干预RA热证的网络调控机制初探1.3.1 白虎加桂枝汤效应基因集收集转录组表达谱中白虎加桂枝汤反向调控基因收集:以FC≥2.0或≤0.5,p＜0.05为差异筛选标准,采用转录组表达谱检测AIA热证+白虎加桂枝汤给药与AIA热证模型组在大鼠受累关节滑膜组织及外周血细胞样本中的差异表达基因（AIA-H+BHGZD vs.AIA-H）共得到1802个差异表达基因。筛选转录组表达谱中白虎加桂枝汤反向调控AIA热证的基因集,共得到137个基因。白虎加桂枝汤候选靶标谱预测:基于TCMIP v2.0,预测知母、桂枝和甘草三味药材所含成药性等级为中～高级的化学成分的候选靶标谱（可信度得分＞0.8）,共得到238个基因;基于ETCM预测31个白虎加桂枝汤入血化学成分（桂枝1个,甘草16个,知母14个）的候选靶标谱（可信度得分＞0.8）,共得到184个基因;基于TCMIP v2.0,预测石膏所含化合物的靶标信息（可信度得分＞0.8）,共得到197个基因;基于BATMAN-TCM,预测粳米所含化学成分的靶标信息（可信度得分＞80）,共53个基因。整合上述转录组表达谱中白虎加桂枝汤反向调控AIA热证基因集及白虎加桂枝汤候选靶标,共得到635个基因,将此数据集作为白虎加桂枝汤候选靶标集。1.3.2“白虎加桂枝汤候选靶标-RA热证基因”相互作用网络构建与分析基于String数据库,获得上述635个白虎加桂枝候选靶标（即白虎加桂枝汤效应基因集及靶标基因集）,及474个AIA热证发病相关基因（即AIA热证模型与正常对照大鼠组间差异基因集）的相互作用信息,建立白虎加桂枝汤干预RA热证相关分子网络,该网络包括659个节点和3614对相互作用;计算上述网络中659个节点的拓扑特征值,以三个拓扑特征值大于相应中位数为卡值（Betweenness Centrality、Closeness Centrality 及 Degree的中位数分别为0.00093571、0.28602909及7）,共筛选到196个关键hub节点;基于KEGG数据库功能富集分析,发现上述196个白虎加桂枝汤干预AIA热证分子网络的关键节点与机体免疫-炎症调节、能量代谢失衡、血管新生及血液循环、疼痛、骨破坏、激素合成相关通路、神经系统调节、细胞功能及细胞间信号转导等通路密切相关;基于Reactome数据库通路富集结果与KEGG功能富集结果相一致;整合上述KEGG及Reactome两个通路数据库的富集分析结果,根据通路的生物学功能,将白虎加桂枝汤干预AIA热证关键网络靶标划分为如下6个功效分子模块:血液循环调节模块、调节机体“免疫-炎症”平衡模块、降低机体能量代谢水平及解热功能模块、神经系统调节和镇痛功能模块、骨保护功能模块、细胞内或细胞间信号转导及细胞功能调控模块。1.4从“免疫-炎症”失衡环节,挖掘白虎加桂枝汤干预RA热证的网络调控机制提取“白虎加桂枝汤候选靶标-AIA热证基因”相互作用网络中196个关键hub节点,发现6个关键网络靶标（PI3K、AKT1、NFκB、IL-6、IL-1 β及TNF）在机体“免疫-炎症”平衡模块中占据重要作用。通过构建“药物-成分-靶标-通路”多层次相互作用网络,及文献调研结果,最终确定白虎加桂枝干预RA热证,发挥抗炎和免疫功能的候选靶标可能为TLR4-PI3K-AKT1-NF κ B-NLRP3-IL-1β信号通路。1.5白虎加桂枝汤可显著抑制LPS/ATP诱导的细胞焦亡1.5.1 白虎加桂枝汤可显著抑制LPS/ATP诱导Raw264.7细胞焦亡光学显微镜下观察到Raw264.7空白对照组细胞形态呈圆形,颗颗分明;在LPS/ATP诱导后Raw264.7细胞膨胀或呈半透明状、凸起、变形,细胞膜破裂,细胞核浓缩;在白虎加桂枝汤在7.14、14.27及28.54μg/mL剂量作用下,半透明状或膨胀细胞数明显减少;LPS/ATP诱导模型组FITC Annexin V-PI染色细胞焦亡率显著升高,可达43.02%,白虎加桂枝汤在7.14、14.27及28.54μg/mL剂量下可呈剂量依赖性地降低LPS/ATP诱导的高细胞焦亡率,且在14.27及28.54μg/mL剂量下具有显著性差异;LPS/ATP诱导模型组中FLICA与PI阳性率较空白对照组均显著升高;与LPS/ATP诱导模型组相比,7.14、14.27及28.54μg/mL的白虎加桂枝汤给药后FLICA及PI荧光强度均显著下降,表明方剂可抑制细胞焦亡及CASP1的表达。MCC950是一种有效的、选择性NLRP3抑制剂,也表现出对caspase-1活性的抑制作用;流式细胞术的检测结果与荧光表达结果相一致。1.5.2 白虎加桂枝汤可显著抑制LPS/ATP诱导MH7A细胞焦亡光学显微镜下观察到MH7A空白对照组细胞形态成明显纤维状,颗颗分明,细胞边界清晰;在LPS/ATP诱导后细胞皱缩为圆形,呈半透明状,细胞膜破裂,细胞核浓缩;在白虎加桂枝汤在7.14、14.27及28.54μg/mL剂量作用下,圆形细胞、半透明状或膨胀细胞数明显减少;与上述研究结果相一致,在LPS/ATP诱导下,细胞TUNEL 阳性率显著升高,镜下可观察到明显红色荧光;在7.14、14.27和28.54μg/mL白虎加桂枝汤给药后可显著抑制LPS/ATP诱导的细胞焦亡,镜下红色荧光显著降低。1.5.3 尚未检测到白虎加桂枝汤对Raw264.7及MH7A两种细胞产生细胞毒性采用CCK-8检测及流式细胞术检测,尚未发现白虎加桂枝汤7.14、14.27及28.54μg/mL剂量下造成细胞毒性,且白虎加桂枝汤在Raw264.7细胞中的EC50为14.27μg/mL。1.6白虎加桂枝汤可显著抑制体内外TLR4-PI3K-AKT1-NFκB-NLRP3-IL-1β信号通路相关分子表达1.6.1 白虎加桂枝汤可显著抑制RA病证结合大鼠体内TLR4-PI3K-AKT1-NFκB-NLRP3-IL-1β信号通路相关蛋白的表达Western blotting结果显示,AIA热证及AIA寒证模型大鼠膝关节中TLR4、p-PI3K/PI3K、p-AKT1/AKT1、p-NF κ B/NF κ B、NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD-NT 及 IL-1 β 蛋白表达显著高于空白对照组,且上述蛋白分子在AIA热证模型中的表达高于AIA寒证模型,表明RA病证结合大鼠模型中存在“免疫-炎症”系统失调,且AIA热证大鼠模型中炎症反应及免疫系统失调现象更为剧烈;白虎加桂枝汤给药后,可显著抑制AIA热证及AIA寒证模型大鼠膝关节中上述蛋白的表达,与阳性药MTX的作用相似;方剂对AIA热证模型大鼠中ASC和GSDMD-NT蛋白的抑制作用强于对AIA寒证的调控,表明白虎加桂枝汤对RA热证TLR4-PI3K-AKT1-NFκB-NLRP3-IL-1β信号通路介导的免疫-炎症系统的显著调控作用;同样地,AIA热证及AIA寒证模型大鼠膝关节中NLRP3 mRNA异常高于空白对照组,白虎加桂枝汤给药后可显著抑制两模型大鼠中该分子的表达;大鼠血清ELISA检测结果显示,AIA热证及AIA寒证模型组中TLR4、IL-1 β和IL-18蛋白含量及caspase-1和LDH活性均显著高于空白对照组,且TLR4、caspase-1、LDH及IL-18分子在AIA热证模型中的表达高于AIA模型;白虎加桂枝汤给药后,以上分子的表达均显著下降,与阳性药MTX的作用相似;且方剂对AIA热证模型中caspase-1及IL-1 β的抑制作用强于AIA寒证模型。1.6.2 白虎加桂枝汤可显著抑制LPS/ATP诱导细胞焦亡模型中TLR4-PI3K-AKT1-NFκB-NLRP3-IL-1β信号通路相关蛋白的表达白虎加桂枝汤可显著抑制LPS/ATP诱导的细胞焦亡模型中TLR4-PI3K-AKT1-NFκB-NLRP3-IL-1β信号通路相关蛋白的异常高表达,与体内整体实验相一致。2.芒果苷和肉桂酸为白虎加桂枝汤缓解RA热证发挥抗炎和免疫调节的代表性药效物质2.1基于UFLC-Q-TOF-MS/MS白虎加桂枝汤入血成分鉴定及体内ADME预测基于UFLC-Q-TOF-MS/MS技术,共检测到31个白虎加桂枝汤入血成分,分别归属于甘草（16个）、知母（14个）和桂枝（1个）,化合物类型为皂苷、糖苷、有机酸、黄酮类及三萜类。其中,13个成分采用标准品对照进行定量,且均可在给药30min后检出。基于ETCM（http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/）数据库,及前期建立的计算机ADME模型,通过计算各化合物的肠道吸收率和口服生物利用度,共得到8个成药性较好的白虎加桂枝汤所含化学成分（Druglikeness＞0.4）。2.2芒果苷和肉桂酸与TLR4-PI3K-AKT1-NFκB-NLRP3-IL-1β信号通路中关键靶标有较强结合能力采用分子对接虚拟筛选将上述具有生物活性的化学成分与TLR4-PI3K-AKT1-NFκ B-NLRP3-IL-1β信号通路中关键靶标蛋白进行分子对接虚拟筛选,发现9个化合物与上述靶标蛋白分子具有较好的结合能力（对接结合能＜-4kcal/mol）,其中芒果苷与TLR4、AKT1及NFκ B-p65的对接结合能分别为-6.6、-9.2和-7.7kcal/mol,肉桂酸与TLR4、AKT1及NF κB-p65的对接结合能分别为-6.1、-6.6和-5.3kcal/mol;采用SPR和MST进一步验证,发现肉桂酸与TLR4蛋白（KD=2.11e-4 M）和芒果苷与AKT1蛋白（KD=3.83e-5 M）有较强的的结合能力。2.3白虎加桂枝汤累积给药后,芒果苷和肉桂酸在大鼠体内有较高的累积浓度本项目组前期基于UFLC-Triple-TOF-MS/MS法对白虎加桂枝汤中所含化学成分进行定量,发现芒果苷和肉桂酸在1mg白虎加桂枝汤冻干粉中的含量为336.96ng和26.14ng（冻干粉转换率为8.33%,即1g白虎加桂枝汤等同于12g白虎加桂枝汤原药材,由白虎加桂枝汤冻干粉重量与原药材总重量相比）。经计算,等同白虎加桂枝汤给药剂量（21.4g/kg,2倍临床等效剂量）的芒果苷和肉桂酸的给药剂量分别为600.91mg/kg和46.62mg/kg;采用UPLC-MS/MS方法,对大鼠血清中化学成分进行定量研究,进行方法学考察,结果显示方法学的选择性、内标残留、线性和定量下限（Lower Limit of quantitation,LL0Q）、精密度和准确性、基质效应及稳定性均符合生物样品定量分析方法要求;单次剂量及累积给药13天给予大鼠白虎加桂枝汤（21.4g/kg）后,采用UHPLC-QTRAP-MS/MS检测不同时间点大鼠血清中候选药效物质的含量。结果显示,白虎加桂枝汤单次剂量给药后大鼠血清中芒果苷和肉桂酸Cmax分别为48.103μg/L和53.306μg/L,Tmax分别为2.563h和0.375h;累积给药13天后芒果苷和肉桂酸Cmax为单次剂量给药的2.635和2.004倍,分别为126.735μg/L和106.825μg/L,Tmax分别为3.875h（为单次剂量给药1.512倍）和0.250h（为单次剂量给药的0.667倍）。这一结果表明,中药多次累积给药可在某种程度上提高体内入血成分血药浓度分布。3.白虎加桂枝汤及芒果苷和肉桂酸组合可有效缓解RA热证模型大鼠疾病严重程度,其作用机制可能与机体“免疫-炎症”平衡相关的TLR4-PI3K-AKT1-NFκ B-NLRP3-IL-1β信号通路3.1芒果苷和肉桂酸组合可有效缓解RA热证模型大鼠疾病严重程度和病证特征指标3.1.1 芒果苷和肉桂酸组合可有效缓解RA热证及RA寒证模型大鼠关节炎严重程度,尤以治疗RA热证为佳,其药效与白虎加桂枝汤相当与前期研究结果相一致,AIA、AIA热证及AIA寒证模型大鼠关节明显红肿、畸变症状明显,芒果苷和肉桂酸组合给药改善AIA热证模型大鼠关节的病变程度,降低关节炎临床积分和后肢肿胀度,延长首次发病时间（为免疫第12天）,缓解体重下降,尤以对AIA热证模型大鼠的改善作用更为显著,与白虎加桂枝汤作用相当;自免疫第5、10及15天起至给药结束,AIA、AIA热证和AIA寒证模型大鼠的三种痛阈值（机械痛阈值、冷痛阈值和热辐射痛阈值）均显著降低,芒果苷和肉桂酸组合给药后显著提高AIA热证及AIA寒证模型大鼠的三种痛阈值,表现为减少退缩反应频率、降低冷刺激反应评分并延长反应时间,尤以对AIA热证模型大鼠的改善作用更为显著,与白虎加桂枝汤作用相当;Micro-CT扫描结果显示,空白对照组大鼠膝/踝关节表面光滑、外形完整;AIA、AIA热证及AIA寒证模型大鼠关节膝/踝关节表面凹凸不平、外形不完整,骨计量学指标中BMD、TMD、BV/TV及Tb.Th.均显著降低,BS/BV及Tb.Sp.则显著升高;与AIA热证及AIA寒证模型组相比,芒果苷和肉桂酸组合给药后膝/踝关节表面稍光滑,外形较完整,BMD、TMD、BV/TV及Tb.Th.均显著升高,BS/BV及Tb.Sp则显著降低,与白虎加桂枝汤作用相当;H＆E染色结果显示,AIA、AIA热证及AIA寒证模型大鼠骨与软骨破坏严重,大量炎性细胞浸润和滑膜增生严重。芒果苷和肉桂酸组合可显著改善AIA热证和AIA寒证模型大鼠骨与软骨破坏,降低炎性细胞浸润、骨破坏和滑膜增生评分,尤以对AIA热证模型大鼠的改善作用更为显著,与白虎加桂枝汤作用相当;番红-0-固绿与masson三色染色结果显示,AIA、AIA热证及AIA寒证模型大鼠软骨表面粗糙、缺失,软骨损伤严重,芒果苷和肉桂酸组合给药可显著改善AIA热证和AIA寒证模型大鼠软骨损伤,尤以对AIA热证模型大鼠的改善作用更为显著,与白虎加桂枝汤作用相当;胸腺/脾脏H＆E染色结果显示,空白对照组胸腺结构清晰,皮质和髓质比例正常,着色较深;AIA、AIA热证及AIA寒证模型组胸腺结构清晰,皮质区增宽,淋巴细胞明显增生,皮质/髓质比例增大,颜色较浅;白虎加桂枝汤及芒果苷和肉桂酸组合给药后,胸腺皮质淋巴细胞数量减少,颜色变浅,皮、髓质比例正常。空白对照组脾脏结构清晰,红髓、白髓和边缘区比例正常,脾小体B细胞和动脉周围淋巴鞘T细胞数量正常;AIA、AIA热证及AIA寒证模型组脾脏结构清晰,脾小体变大,B淋巴细胞明显增生,可见明显生发中心;白虎加桂枝汤及芒果苷和肉桂酸组合给药后,脾小体T、B区分界明显,结构清晰,淋巴细胞密度略低,数量轻微减少。AIA、AIA热证及AIA寒证模型组中胸腺指数和脾脏指数显著升高,白虎加桂枝汤及芒果苷和肉桂酸组合给药后,胸腺指数和脾脏指数显著降低,尤以对AIA热证模型大鼠的改善作用更为显著,与白虎加桂枝汤作用相当。3.1.2 芒果苷和肉桂酸组合可有效改善RA热证及RA寒证模型大鼠关节炎病证特征指标,尤以治疗AIA热证为佳,其药效与白虎加桂枝汤相当AIA、AIA热证及AIA寒证模型大鼠关节表面温度较正常对照组相比显著升高,其中AIA热证模型大鼠的关节表面温度较单纯AIA模型高,AIA寒证模型较单纯AIA模型低。芒果苷和肉桂酸组合可显著降低AIA热证及AIA寒证模型大鼠的关节表面温度,尤以对AIA热证模型大鼠的改善作用更为显著,与白虎加桂枝汤作用相当;受后足肿胀引起的行动不便的影响,各模型组大鼠的每日饮水量均较正常大鼠组低,AIA热证模型大鼠的每日饮水量较AIA单纯模型组高,而AIA寒证模型大鼠则相反。芒果苷和肉桂酸组合对AIA热证和AIA寒证模型大鼠每日饮水量均有一定的缓解作用。3.1.3 芒果苷和肉桂酸组合对各组大鼠不产生肝肾毒性肝脏组织病理学检测发现,各模型组和给药组大鼠的肝脏无炎症或坏死,肝脏指数无明显变化;肾脏组织病理学检测发现,各模型组和给药组大鼠肾脏的肾小球和肾小管无变性或坏死,肾脏指数无明显变化。3.2芒果苷和肉桂酸组合可显著抑制LPS/ATP诱导的细胞焦亡3.2.1 芒果苷和肉桂酸组合可显著抑制LPS/ATP诱导的Raw264.7细胞焦亡空白对照组细胞形态呈圆形,颗颗分明;在LPS/ATP诱导后Raw264.7细胞膨胀或呈半透明状、凸起、变形,细胞膜破裂,细胞核浓缩;在芒果苷、肉桂酸及芒果苷和肉桂酸组合作用下,半透明状或膨胀细胞数明显减少,与白虎加桂枝汤作用相似,且单独芒果苷或肉桂酸作用下抑制作用较弱;LPS/ATP诱导模型组FITC Annexin V-PI染色细胞焦亡率显著升高,可达27.36%;芒果苷、肉桂酸及芒果苷和肉桂酸组合作用下,细胞焦亡率均显著降低,且与白虎加桂枝汤相比具有显著差异;与芒果苷和肉桂酸组合组相比,单独芒果苷或肉桂酸作用下抑制作用较弱;且LPS/ATP诱导组中FLICA与PI阳性率均显著高于空白对照组,芒果苷和肉桂酸组合作用后FLICA及PI荧光强度均显著下降,与白虎加桂枝汤作用无明显差异;而单独芒果苷或肉桂酸作用后亦可抑制LPS/ATP诱导的高阳性率,但显著弱于芒果苷和肉桂酸组合作用。3.2.2 芒果苷和肉桂酸组合可显著抑制LPS/ATP诱导的MH7A细胞焦亡LPS/ATP诱导组细胞TUNEL 阳性率显示升高,芒果苷和肉桂酸组合作用后TUNEL 阳性率显著下降,与白虎加桂枝汤作用无明显差异;单独芒果苷或肉桂酸作用后TUNEL阳性率虽有下降,但与芒果苷和肉桂酸组合作用相比较弱。3.2.3 芒果苷和肉桂酸在有效剂量下无明显细胞毒性CCK-8检测显示,芒果苷在0.21、0.42、0.84、1.69、3.37及6.74ng/mL浓度下,以及肉桂酸在0.02、0.34、0.07、0.13、0.26及0.52ng/mL浓度下尚未对Raw264.7野生细胞产生细胞毒性。3.3芒果苷和肉桂酸组合可显著抑制体内外TLR4-PI3K-AKT1-NFκB-NLRP3-IL-1β信号通路相关分子表达3.3.1 芒果苷和肉桂酸组合可显著抑制RA病证结合大鼠体内TLR4-PI3K-AKT1-NFκB-NLRP3-IL-1β信号通路相关分子表达,尤以对RA热证大鼠中相关分子的调节作用较强TUNEL染色结果显示,AIA、AIA热证及AIA寒证模型大鼠受累关节滑膜组织出现大量焦亡细胞,芒果苷和肉桂酸组合给药后可显著抑制细胞焦亡,尤以对AIA热证模型大鼠的改善作用更为显著,与白虎加桂枝汤作用相当;Western blotting检测结果显示,AIA热证模型和 AIA 寒证模型大鼠受累关节中 TLR4、p-PI3K/PI3K、p-AKT1/AKT1、p-NF κ B/NF κ B、NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD-NT及IL-1 β蛋白异常升高,芒果苷和肉桂酸组合可显著调节AIA热证及AIA寒证模型大鼠受累关节中以上蛋白的异常变化,与白虎加桂枝汤的相似;AIA、AIA热证及AIA寒证模型大鼠血清中TLR4、IL-1 β、IL-18、TNF-α、IL-6和IL-12蛋白表达及caspase-1、GSDMD-NT和LDH活性均显著升高,芒果苷和肉桂酸组合可显著抑制AIA热证及AIA寒证模型大鼠血清中以上分子的异常高表达,尤以对AIA热证模型大鼠的改善作用更为显著,与白虎加桂枝汤作用相似;受累关节软骨及滑膜组织中NLRP3蛋白表达结果与western blotting检测结果相一致。3.3.2 芒果苷和肉桂酸组合可显著抑制LPS/ATP诱导细胞焦亡模型中TLR4-PI3K-AKT1-NFκB-NLRP3-IL-1β信号通路相关分子表达芒果苷和肉桂酸组合可显著抑制Raw264.7及MH7A细胞中TLR4-PI3K-AKT1-NFκB-NLRP3-IL-1β信号通路相关分子的异常高表达,与白虎加桂枝汤的作用相似,与体内整体实验相一致。研究结论本研究通过转录组表达谱和网络药理学分析,采用药物靶标预测、网络分析、分子对接虚拟筛选、SPR/MST验证及药代动力学检测整合研究策略,并与体内外实验验证相结合,筛选白虎加桂枝汤缓解RA热证的代表性药效物质,并探究其潜在机制。相关研究结论如下:1.基于具有RA热证表型的AIA热证大鼠受累关节滑膜组织及外周血细胞的转录组表达谱数据,建立AIA热证相关分子网络,通过网络拓扑特征值计算和功能挖掘,发现AIA热证相关分子主要参与机体炎症反应和免疫调节相关生物学反应,其次参与类风湿关节炎、血液循环、能量代谢与骨破坏等相关通路;2.经“病证标志-药物靶标”互作网络构建和分析,发现白虎加桂枝汤对AIA热证分子网络干预作用显著。其作用靶标主要参与调节机体“免疫-炎症”失衡,其次为降低机体能量代谢及解热和调节血液循环和血管新生,还参与神经调节和镇痛、骨保护、细胞内或细胞间信号转导及细胞功能调控。进一步分析挖掘发现,与机体“免疫-炎症”平衡相关的TLR4-PI3K-AKT1-NFκB-NLRP3-IL-1β信号通路可能是白虎加桂枝汤缓解RA热证的关键作用靶标;3.基于RA病证结合大鼠模型整体实验,发现白虎加桂枝汤可显著缓解AIA热证及AIA寒证模型大鼠的疾病严重度,改善疾病严重指标和病证特征指标,尤以对AIA热证的改善作用更为显著,并扭转TLR4-PI3K-AKT1-NFκB-NLRP3-IL-1β信号通路相关分子的异常表达,缓解RA热证的发生和进展;4.基于Raw264.7细胞和MH7A细胞的体外研究表明,白虎加桂枝汤可通过调节机体“免疫-炎症”平衡相关的TLR4-PI3K-AKT1-NFκB-NLRP3-IL-1β信号通路相关分子的异常表达,显著抑制LPS/ATP诱导的细胞焦亡;5.结合白虎加桂枝汤入血成分鉴定、体内ADME特性评价、分子对接虚拟筛选、SPR/MST验证及药代动力学检测,发现知母中芒果苷和桂枝中肉桂酸与TLR4-PI3K-AKT1-NFκB-NLRP3-IL-1 β信号通路的关键靶标蛋白有较强结合能力,且在大鼠体内有较高体内暴露量,推测芒果苷和肉桂酸可能是白虎加桂枝汤缓解RA热证的代表性药效物质;6.基于RA病证结合大鼠模型整体实验,发现芒果苷和肉桂酸组合可显著缓解AIA热证及AIA寒证模型大鼠的疾病严重度,改善疾病严重指标和病证特征指标,尤以对AIA热证的改善作用更为显著,并扭转机体“免疫-炎症”平衡相关的TLR4-PI3K-AKT1-NFκB-NLRP3-IL-1β信号通路相关分子的异常表达,其药效和作用机制与白虎加桂枝汤相当;7.基于Raw264.7细胞和MH7A细胞的体外研究表明,芒果苷和肉桂酸组合可通过调节TLR4-PI3K-AKT1-NFκB-NLRP3-IL-1β信号通路相关分子的异常表达,显著抑制LPS/ATP诱导的细胞焦亡,其作用与白虎加桂枝汤相似;且单独芒果苷或肉桂酸的药效不及二者组合或白虎加桂枝汤全方。综上所述,本研究采用转录组表达谱和网络药理学分析整合研究,整合药物入血成分检测、靶标预测、网络分析、分子对接虚拟筛选、SPR/MST验证及药代动力学检测等方法与体内外实验验证,发现白虎加桂枝汤通过调节机体“免疫-炎症”平衡相关的TLR4-PI3K-AKT1-NFκB-NLRP3-IL-1β信号通路,发挥缓解RA热证的药效,知母中的芒果苷和桂枝中的肉桂酸是白虎加桂枝汤发挥抗炎和免疫调节的代表性药效物质。初步揭示了其“疗热以寒药”的调节机理及其与功效的相关性,为后续开展RA个体化治疗提供方法学探索和实验依据。