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RNA沉默(RNA silencing)介导的植物抗病毒研究是近年来广泛采取的一项抗病毒基因工程策略。齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus, ORSV)和建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus, CymMV)是兰科植物中发病最广、危害最大的两种病毒。兰科植物是多年生重要经济作物,转基因抗病品种培育,其外植体离体培养周期长是重要瓶颈,为克服上述困难,本实验研究选取模式植物本氏烟(Nicotiana benthamiana)进行抗病毒研究,本氏烟具有操作方便、易于栽培、生长周期短、离体再生频率高等特点,是实验室理想的模式植物。本实验室针对ORSV和CymMV两种病毒分别构建了沉默载体：将两种病毒的部分外壳蛋白基因(coat protein, CP)的反向重复序列(inverted repeat, IR)插入表达载体pXGYl,并转化农杆菌获得重组子。本研究基于RNA沉默原理,以农杆菌浸润法在本氏烟中瞬时表达与病毒CP同源的发卡RNA (hairpin RNA, hpRNA),并接种病汁液,观察植株症状并利用分子生物学技术检测接种植株的感病情况。为了获得抗性稳定和可遗传的植株,进行了农杆菌介导的转基因实验,对转基因本氏烟植株抗病毒做了初步研究,研究成果对兰花产业的抗病毒防治具有重要的理论指导意义和应用价值。本实验主要研究结果如下：1、实验通过在本氏烟叶片上分别摩擦接种ORSV病汁液与CymMV病汁液,实验结果观察到本氏烟表现出明显的病症,RT-PCR检测表明病毒侵染成功。说明本氏烟可以作为ORSV与CymMV两种病毒的宿主,为ORSV与CymMV病毒沉默载体的抗病毒研究提供了理想的实验室模式植物。2、本实验通过组合ORSV (CymMV)沉默载体+ORSV(CymMV)病汁液,以农杆菌浸润法处理本氏烟,观察植株症状发现接种的本氏烟未出现病症或者病症较轻,并利用Northern Blot,半定量PCR及Western Blot等分子生物学技术进一步的检测表明,实验处理组0RSV(CymMV)病毒的基因组表达水平都明显低于阳性对照组病毒基因组的表达水平,检测确证了所构建的病毒沉默载体发挥了沉默功能,能够有效的干涉病毒基因组的表达,抵御病毒的入侵。3、为了进一步获得抗性稳定的本氏烟植株,利用农杆菌介导的转基因和组织培养技术成功获得了6株检测为阳性的ORSV沉默植株,4株检测为阳性的CymMV沉默株。利用PAGE/Northern blot分子生物学技术对获得的T。代转基因本氏烟体内的sRNA进行了检测。在转基因植株体内,ORSV/CymMV病毒沉默载体能够稳定表达与病毒CP蛋白基因同源的反向重复结构,转录形成发卡结构进而被切割产生siRNA,此实验还在进一步的研究中。