背景及目的:进入二十一世纪以来,全球老年化的进展,伴随器官移植、肿瘤放化疗以及HIV感染所致的免疫缺陷人群的爆发式增长,使得真菌感染逐渐成为临床上严重的疾病类型。在诸多临床上常见的致病真菌中,新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）是当前全球范围内致病率和致死率最高的病原真菌之一。新型隐球菌是一种广泛存在环境中的机会性真菌病原体,导致全球每年约22万的致命性真菌感染。世界卫生组织在去年最新公布的人类病原真菌预警清单中,新型隐球菌位列危害性最高的四种真菌之一,可见其对人类公共健康带来的日益严峻的威胁。然而,目前临床上抗隐球菌感染药物非常有限,主要依赖于唑类、多烯类以及5-氟胞嘧啶三种药物,而侵袭性隐球感染疾病的治疗周期长,极易产生耐药现象,导致临床治疗非常棘手和困难,急需寻找新出路。基于以上问题,我们课题组其中一个课题是继续探索隐球菌致病与耐药机制,寻找新的药物靶点。在本论文中,通过对新型隐球菌转录组学数据分析发现在抗真菌药物以及某些应激压力下PMP3会表达上调。Pmp3属于高度保守质膜蛋白且在模式真菌酿酒酵母中有较为重要的功能作用。因此,研究Pmp3在新型隐球菌中的功能及其在隐球菌致病与耐药的机制具有较重要的临床意义。以PMP3为研究中心,我们首先计划构建新型隐球菌PMP3突变株,根据突变株的表型实验观察PMP3在新型隐球菌中缺失之后对功能的影响。其次以突变株为背景构建回补和过表达株,进一步验证突变株对功能的影响。最后对受到影响的功能的相关机制探索研究。目的是以对PMP3的研究能为抗真菌药物研发等问题提供新思路和方向。方法:1、CRISP-cas9结合电穿孔技术进行菌株构建:以隐球菌H99为背景,采用CRISPR-Cas9联合电穿孔技术实现目的基因的敲除。通过质粒酶切、无缝克隆技术、pcr构建回补以及过表达质粒,结合CRISPR-Cas9联合电穿孔技术将质粒导入突变菌株中获取过表达及回补菌株。2、PMP3的生物信息学分析对于新型隐球菌的转录组学数据的分析发现了PMP3的转录水平变化。从FungiDB网站中获取PMP3基因序列及氨基酸序列,以PMP3基因序列作为参考序列,通过NCBI-BLAST比对寻找相似序列,所有序列进行系统发育树的构建。3、菌株的温度以及化学应激压力实验（1）为了分析不同温度下菌株的生长情况,将菌株于YPD固体培养基上监测不同温度（30℃和39℃）下的生长情况,48h后拍照。（2）为了分析不同应激压力下菌株的生长情况,将菌株于加有指定化合物（山梨醇、刚果红、过氧化氢、SDS等化学应激压力）的YPD固体培养基上培养,以YPD普通固体培养基为对照,在30℃下孵育48h后拍照记录。4、菌株的药敏性实验为了分析菌株的药敏性,将菌株在加有指定抗真菌药物（两性霉素B、氟康唑、5-氟胞嘧啶）的YPD固体培养基上培养,以YPD固体培养基为对照,在30℃下孵育48h后拍照记录。5、RNA提取以及RT-QPCR收集菌株在YPD液体培养基中培养过夜20h的菌体沉淀,液氮研磨,破壁机破壁后根据RNA提取试剂盒提取RNA样本。测量浓度以及A260/280值达标后,选取一定量（不超过1μg）RNA根据逆转录试剂进行反应获取cDNA。在QPCR反应试剂的说明下进行QPCR反应并分析菌株样本中的ERG1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG6、ERG11、PMP3的相对表达量。6、荧光定位通过构建带有绿色荧光蛋白的PMP3过表达菌株在倒置荧光显微镜下观察PMP3的细胞定位。7、麦角甾醇提取及检测麦角甾醇的提取是采用醇碱皂化方法提取,然后在HPLC以及LC-MS系统中进行定量的测量。菌株在Filipin染色后在倒置荧光显微镜下观察菌株的甾醇-脂质分布情况。8、质膜蛋白质组学过夜培养的菌株裂解破壁之后于超高速离心机离心获取质膜蛋白,质膜蛋白样本进行蛋白质组学分析。结果:1.PMP3基因序列在真核生物中保守2.转录组学分析表明外界压力（温度变化、营养环境、抗真菌药物）会上调隐球菌PMP3转录水平3.PMP3缺失影响新型隐球菌在外界压力（AmB药物）下的生长4.PMP3功能的机制与麦角甾醇合成途径相关基因表达、麦角甾醇含量以及分布、鞘脂合成途径无关5.PMP3突变株与野生型质膜蛋白质组学分析呈现显著性差异,PMP3功能的机制可能与这种差异能建立相关联系结论:1.PMP3缺失影响新型隐球菌在AmB压力下的生长2.PMP3功能的机制与麦角甾醇以及鞘脂无关3.PMP3功能的机制可能与PMP3缺失后质膜蛋白与野生型之间的显著异有相关