目的:在成骨系细胞增殖研究中,流体剪切力通过细胞外信号调节激酶5（Extracellular signal-regulated kinase 5,ERK5）信号通路在成骨系细胞增殖中发挥重要的作用。而靶向沉默Kruppel样因子4（Kruppel-like factor 4,KLF4）已被证实通过增加成骨分化和矿化显著促进骨形成。但是,KLF4在成骨系细胞增殖中的作用还有待阐明。在成骨系细胞分化研究中,骨形态蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）被证实在调控干细胞成骨分化和成脂分化中发挥重要的作用。但是其中具体的机制还有待阐明,而且BMP9是如何调控干细胞成骨分化和成脂分化的平衡的机制还是空白。Leptin是脂肪细胞分泌的因子,在调节脂肪代谢以及能量代谢过程中发挥重要的作用。但是Leptin是否参与调控BMP9诱导的成骨分化和成脂分化平衡还不清楚。因此,本篇实验是为了阐明KLF4对成骨系细胞增殖的作用,以及KLF4和ERK5之间的关系;Leptin在BMP9诱导的干细胞成骨分化和成脂分化平衡中发挥的作用。方法:在成骨系细胞增殖研究中,成骨MC3T3-E1细胞分别给予流体剪切力和/或KLF4 siRNA或ERK5 siRNA处理,采用EdU染色和CCK-8实验检测细胞活性,采用PCR微阵列检测增殖基因表达。骨髓间充质干细胞（BMSCs）感染过表达KLF4重组腺病毒和/或持续活性丝裂原激活蛋白激酶激酶5（MEK5）,采用结晶紫染色、克隆形成实验、细胞WST-1检测细胞增殖活性,采用qRT-PCR、western blot实验检测KLF4表达水平和ERK5磷酸化水平。在成骨系细胞分化研究中,BMSCs和永生化小鼠胚胎纤维母细胞（immortalized mouse embryonic fibroblasts,iMEFs）分别感染过表达BMP9、过表达Leptin、沉默Leptin的重组腺病毒,采用ALP染色、ALP活性读数、茜素红S染色、油红O染色、qRT-PCR检测细胞ALP活性、钙盐沉积、脂滴形成以及mRNA表达情况。将BMSCs和iMEFs分别感染过表达BMP9、过表达Leptin、沉默Leptin的重组腺病毒,在36h收集细胞,将收集的细胞在裸鼠背部两侧进行皮下注射,4周后提取包块,采用microCT、H&E染色、Trichrome染色的方法,检测异位成骨包块的体积、骨密度和脂肪分化情况。采用JAK1/2抑制剂Ruxolitinib处理BMP9过表达、Leptin过表达、沉默Leptin腺病毒感染的干细胞,检测ALP活性,qRT-PCR检测成骨分化和成脂分化相关的基因表达。结果:在成骨系细胞增殖研究中,成骨细胞加载生理性流体剪切力4h显著下调KLF4表达,但此过程可被ERK5 siRNA所逆转。过表达KLF4重组腺病毒抑制BMSCs的细胞克隆形成效率和细胞活性。过表达MEK5重组腺病毒增加BMSCs的ERK5磷酸化水平,降低KLF4表达,促进细胞增殖。沉默KLF4或流体剪切力促进增殖相关基因Cyclin B2和Cdc14b表达升高,P27表达降低。在成骨系细胞分化研究中,BMP9过表达重组腺病毒显著升高BMSCs和iMEFs中ALP活性,增加钙盐沉积,促进脂滴形成,增加异位骨形成体积和骨密度,而过表达Leptin重组腺病毒显著增加BMP9诱导的干细胞中ALP活性、钙盐沉积,异位骨形成体积和骨密度,但是可减少BMP9诱导的干细胞中脂滴形成。沉默Leptin腺病毒对BMP9诱导的干细胞中ALP活性、钙盐沉积、脂滴形成以及异位骨形成体积和骨密度没有明显影响。BMP9过表达促进iMEFs中Leptin和Leptin受体表达增加,而过表达Leptin可上调iMEFs中BMP9表达。BMP9过表达显著增加iMEFs中ALP活性,但是此效应可被10μM Ruxolitinib所逆转,而且Leptin过表达显著升高BMP9诱导的iMEFs中ALP活性,但此效应可被10μM Ruxolitinib所逆转。iMEFs给予10μM Ruxolitinib处理可抑制过表达BMP9上调的IL6、OPG表达量,可促进过表达BMP9诱导的Col10a1表达。而过表达Leptin显著增加BMP9诱导的IL6和OPG表达,降低BMP9诱导的Col10a1、PPARγ2和LPL表达,但此效应可被10μM Ruxolitinib处理所逆转。结论:流体剪切力或MEK5过表达通过ERK5负性调控KLF4表达并促进成骨系细胞增殖。Leptin增强BMP9诱导的干细胞成骨分化,抑制BMP9诱导的成脂分化,并通过JAK1/2信号通路增加BMP9诱导的IL6、OPG表达,降低BMP9诱导的Col10a1、PPARγ2和LPL表达。