牙髓是牙体组织内唯一的软组织，承担着不断形成牙本质和向牙齿硬组织提供营养的重要功能。牙髓因受创或感染导致暴露时，其储备的未分化间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)迁移至损伤处增殖、分化为成牙本质样细胞，并分泌牙本质基质形成修复性牙本质，这是牙髓自身修复的潜能，也是活髓保存治疗的生物学基础。然而传统的活髓保存方法是利用生物活性分子促进损伤牙髓的修复，但生物活性分子在体内易被吸收，所需剂量大，限制了其在临床中的应用；此外，龋病、外伤等使牙髓组织因感染而去除后，采用根管治疗的方法使牙齿变得易碎，从而降低了牙齿的功能和使用质量。因此，学者们探索采用牙髓干细胞(dental pulp stemcells, DPSCs)作为种子细胞的组织工程方法来修复和重建牙髓组织，以便使患者获得更好的生存质量。组织工程是模拟体内生长因子微环境，将细胞生物材料生长因子复合物植入机体组织、器官病损部位，形成具有特定形态和功能的相应组织、器官，而生物材料在形成新组织过程中逐渐降解吸收。然而生物材料尚存在交叉感染及免疫排斥问题，而生长因子则存在输送载体选择、适宜剂量的确定、半衰期的影响及种属来源免疫反应等问题，从而限制了组织工程在牙髓牙本质再生领域的临床应用。富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin, PRF）被认为是第二代富血小板浓缩物，其制备简单、完全取自于自体血、不添加任何人工制剂等特点，从而避免了伦理道德的争议及免疫排斥和血液交叉感染的风险；其富含多种生长因子，已有研究证实其对多种MSCs的增殖、分化均具有促进作用，因此PRF的出现为牙髓牙本质的修复再生提供了可能性。但PRF复合牙髓干细胞植入去髓的牙髓腔后的修复机制还不清楚需要进一步系统的研究。本课题在体外分离、培养与鉴定犬牙髓干细胞的基础上，拟通过体内、外研究来评估PRF在牙髓牙本质再生中可能发挥的生物学效应以及构建组织工程化牙髓牙本质结构的可行性，以期为组织工程化牙髓牙本质最终的临床应用提供新的契机与研究基础。1.犬牙髓干细胞的分离、培养与鉴定犬麻醉后，从犬上颌第一磨牙中获取牙髓，并通过酶消化法分离、培养犬DPSCs，并通过有限稀释法克隆化传代培养犬牙髓干细胞，检测其克隆形成率；采用流式细胞仪鉴定干细胞表面标记物；通过MTT及成骨/成牙本质诱导、成脂诱导等检测细胞的增殖与多向分化能力。2.富血小板纤维蛋白的制备将同一犬麻醉后，一次性注射器于犬颈部采集静脉全血约10ml，纱布压迫止血，随即将血液转入无菌玻璃离心管中，用盛有相同体积水的离心管配平后，立即置于离心机以3000r∕min离心10min，静置3～5min即可得到纤维蛋白凝块，此时血液分3层，中间层即为PRF凝胶。将其中多余的液体挤出，即可获得柔韧的纤维蛋白膜。将PRF纵向剪开使红端均匀分部，将PRF分为1/8PRF、2/8PRF、3/8PRF组，在实验第1d将PRF加入相应培养液中，与细胞共培养7d后去除，用于观察不同浓度PRF对犬牙髓干细胞的生物学效应。3.富血小板纤维蛋白对基于DPSCs的牙髓牙本质再生效应的影响将不同浓度的PRF加入正常培养液及成牙本质/骨成诱导液，研究PRF对DPSCs体外增殖及成牙本质/成骨能力的影响。结果表明：不同浓度PRF在7d连续培养期内均能明显促进犬牙髓干细胞的增殖，该促进作用具有明显时间依赖性而无PRF浓度依赖性。不同浓度PRF可通过上调成牙本质/成骨早期标记基因ALP、DSPP及晚期标记基因DMP1来促进犬牙髓干细胞成牙本质/成骨方向分化，该效应既具时间依赖性又具有PRF浓度依赖性。4.富血小板纤维蛋白对DPSCs的体内组织再生能力的影响体内研究结果表明：将PRF复合犬牙髓干细胞膜片构建DPSCs/PRF双膜复合体后植入裸鼠皮下，4w、8w取材后HE及Masson染色发现，DPSCs/PRF双膜复合体较单纯的DPSCs膜片组具有更强的形成牙髓牙本质样组织的能力。犬取材标本HE染色结果显示，DPSCs/PRF双膜复合体植入组在8w时有较典型的类牙髓牙本质样组织形成；Masson染色、DSPP及BrdU标记细胞免疫组化发现髓腔内有明显的血管、成牙本质样细胞及牙本质样基质形成，且植入的犬牙髓干细胞是新生组织的主要细胞基础。综上所述，自体PRF与犬牙髓干细胞有良好的生物学相容性，不同浓度的PRF在犬DPSCs体内外增殖与分化中均有促进作用，利用PRF的这种特性，本课题组构建的新型DPSCs/PRF双膜复合体移植物，将牙髓干细胞与自体PRF有机结合，可在异位及原位成功实现类牙髓牙本质再生修复。该研究所取得的进展有望为组织工程化牙髓牙本质复合体的构建乃至临床应用提供新的契机。