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目的:肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种以运动神经元选择性丢失为特征的神经系统退行性疾病,其表现为肢体无力和瘫痪,并最终发展至呼吸肌无力,进而危及生命,一般在发病后3-5年死亡。目前,关于ALS发病机制的研究有很多,主要有遗传、谷氨酸盐的毒性、氧化损伤、神经细丝的改变、蛋白质异常聚集、神经炎症、线粒体变性、自身免疫、及自噬功能的异常等。近年来,自噬功能的异常逐渐成为人们的研究热点。mTOR(mammalian target of rapamycin),即为哺乳类雷帕霉素的靶点,是关于细胞生长和新陈代谢的调节器。mTOR调节细胞的过程,包括mRNA的翻译,核糖体的形成,自噬,以及新陈代谢等。通过对来自外界环境信号的整合,mTOR完成了对下游的调节与输出。mTOR是自噬的关键调节点,在生长因子存在和营养丰富的情况下,使自噬通路关闭,进而抑制自噬。雷帕霉素对mTOR有抑制作用,实验证明,雷帕霉素可以通过抑制自噬的负性调节位点mTOR而激活自噬。生理条件下,mTOR的活动是受到Rheb(Rashomolog enriched in brain)所调节的。Rheb,作为RAS样的小GTP酶,位于mTOR的上游,对mTOR的活性起着正性的激活作用。作为细胞生长的中心性质的调节者,通过营养和细胞生长的信号来控制广谱的细胞活动。研究表明,Rheb对mTOR的激活是通过拮抗其内源性抑制剂FKBP38(FK506-binding protein38)而完成的。FKBP38,是FK506绑定蛋白家族的成员。其被药物抑制后,显示了强大的神经保护作用和再生能力,表明了FKBP38的异构酶在调节细胞存活以及稳定性上的能力。在生长因素缺乏或者氨基酸被剥夺的情况下,FKBP38直接与mTOR结合进而下调了mTOR的活性。当氨基酸和生长因子再次恢复时,Rheb与FKBP38相互作用,阻止了其与mTOR的结合,使mTOR解除了失活状态,恢复了活性。SOD1-G93A转基因小鼠是目前研究ALS较理想的动物模型之一,本研究通过观察随着疾病的进展,SOD1-G93A转基因小鼠腰髓中mTOR、FKBP38含量的变化,探讨在ALS中,调节细胞诸多过程的mTOR,与其内源性抑制剂FKBP38的变化对自噬可能产生的影响。进而推断这一变化在ALS中的意义,为ALS的进一步研究提供了理论依据。方法:选取SOD1-G93A转基因小鼠为实验组,根据病程及症状分为症状前期组、症状期组、终末期组;选取100天的阴性小鼠作为对照组,各组8只。通过腹腔注射水合氯醛对小鼠进行麻醉并处死。在4℃条件下迅速剥离腰髓,置于EP管中,保存在-80℃超低温冰箱。用多聚甲醛固定小鼠,分离小鼠腰髓,于多聚甲醛液中固定保存。利用免疫组化技术观察SOD1-G93A小鼠腰髓FKBP38、mTOR的免疫活性;同时,利用Westernblot方法,检测随着疾病的进展,SOD1-G93A小鼠腰髓中,FKBP38、mTOR含量的变化。并利用spss13.0软件对数据进行分析。结果:1SOD1-G93A转基因小鼠腰髓mTOR在不同阶段的表达:利用免疫组织化学技术,我们发现:随着疾病的进展,SOD1-G93A转基因小鼠组腰髓神经元的数量较阴性对照组减少,神经元内mTOR免疫活性降低;利用Western blot技术检测SOD1-G93A转基因小鼠腰髓mTOR表达量,随着疾病的进展,SOD1-G93A转基因小鼠腰髓中mTOR的含量较对照组明显减少。与阴性对照组相比,症状期、终末期SOD1-G93A转基因小鼠腰髓中mTOR的表达量减少;症状前期SOD1-G93A转基因小鼠腰髓中mTOR的含量无显著变化。2SOD1-G93A转基因小鼠腰髓FKBP38的含量:利用免疫组化技术,我们发现:随着疾病的进展,SOD1-G93A转基因小鼠组腰髓中FKBP38的免疫活性是增强的;利用Western blot技术检测SOD1-G93A转基因小鼠腰髓FKBP38表达量,结果显示:随着疾病的进展,SOD1-G93A转基因小鼠腰髓中FKBP38的含量较对照组增多。与阴性对照组相比,症状期、终末期SOD1-G93A转基因小鼠腰髓中FKBP38的表达量增多;症状前期SOD1-G93A转基因小鼠腰髓中FKBP38的含量无显著变化。3SOD1-G93A转基因小鼠腰髓中mTOR、FKBP38随疾病进展的相关性分析:利用统计学方法分析mTOR与FKBP38在SOD1-G93A转基因小鼠不同症状期的相关性,结果表明:mTOR与FKBP38与负正相关,相关系数为-0.692。(Fig.1)结论:通过对SOD1-G93A转基因小鼠腰髓中mTOR和FKBP38前角细胞的形态学观察以及对二者在腰髓中表达量的测定,本实验结果表明,随着疾病的进展,SOD1-G93A转基因小鼠腰髓mTOR的含量是减少的,FKBP38的含量明显增加。由此我们推测,FKBP38含量的增多,增强了其对mTOR的抑制作用,伴随疾病的进展,细胞内能量以及氨基酸逐步减少可能也影响了mTOR的活性,二者共同参与到对mTOR的负性调节过程中,进而使机体的自噬环节受到影响。