第一部分MMP1导致高转移细胞株的高转移能力目的：通过MDA-MB-231免疫缺陷小鼠乳房垫注射,获取高转移细胞株模型；通过对比高低转移细胞体外及体内实验差别,寻找和建立可预测乳腺癌患者复发、转移风险的蛋白质谱系。方法：(1)以MDA-MB-231免疫缺陷小鼠乳房垫注射,获取高转移细胞株；细胞传代40代以上；做核型分析及微卫星分析以确定细胞系种属来源；(2)免疫缺陷鼠乳房垫注射行成瘤实验；肺切片并行HE染色观察肺部肿瘤转移情况；镜下观察细胞形态；(3)以Transwell比较高低转移细胞株间体外细胞转移能力差异；以CCK8试剂盒行体外增殖实验；(4)细胞胞浆蛋白双向电泳；细胞上清蛋白超滤浓缩后行双向电泳；蛋白质质谱分析；Western Blot实验验证；实时PCR确定细胞内外mRNA表达水平差异；(5) MMP1的RNAi质粒构建及稳定转染；V2M4细胞株MMP1基因沉默细胞株建立；稳定转染细胞株免疫缺陷鼠体内注射观察相关参数。结果：(1)成功从MDA-MB-231获得高转移细胞株V2M4；成功获得V2M4子代高转移细胞Vb；细胞稳定传代；细胞核型及微卫星分析均可确定细胞为人源细胞；(2)1×106细胞注射免疫缺陷小鼠后,V2M4成瘤率在两周时100%,Vb成瘤率在4周时100%,MDA-MB-231成瘤率在4周时为33%；成瘤平均体积V2M4为Vb的4倍,为MDA-MB-231的30倍以上；V2M4肺部转移灶明显,且数目繁多,Vb及MDA-MB-231几乎没有明显可见转移灶；镜下可见V2M4与Vb形态类似,与MDA-MB-231向比较明显偏圆形。(3)细胞体外实验结果表明,高、低转移细胞在细胞侵袭实验中差异没有统计学差意义；高、低转移细胞株在细胞增殖实验中差异没有统计学意义；(4)高、低转移细胞株胞浆蛋白经双向电泳、质谱分析后可发现约41个差异蛋白；上清蛋白浓缩后双向电泳、质谱分析后,发现可反复重复的差异蛋白只有MMP1; Western Blot实验证明高转移细胞株胞浆内MMP1蛋白表达量为低转移细胞株的2倍；而高转移株细胞上清浓缩蛋白中MMP1蛋白表达量为为低转移细胞株的1000倍以上,有显著差异；实时PCR证明细胞内MMP1的mRNA的表达差异介于胞浆蛋白与上清蛋白之间；(5)成功构建MMP1基因沉默质粒并得到4个靶位,8个以上克隆,其中两个(720与1052靶位点)基因沉默效率大于70%,稳定转染高转移细胞株V2M4后行免疫缺陷鼠乳房垫注射后相关实验结果,与体外实验一致,注射MMP1基因沉默稳转细胞株的免疫缺陷鼠后成瘤率为16.7%(1/6),肺转移率为16.7%(1/6),而对照组空质粒载体转染的高转移细胞株V2M4注射免疫缺陷鼠后成瘤率为100%(6/6),肺转移率为100%(6/6)。结论：(1)成功构建了具有遗传稳定性的乳腺癌高转移细胞株V2M4。(2)证明V2M4细胞分泌的MMP1是决定细胞高转移性的关键因子。(3)证明高、低转移细胞株的MMP1的差异是在于分泌环节而不是表达水平。第二部分ACTA2调控的MMP1分泌是引起乳腺癌高低转移株差异的原因目的：研究调控MMP1分泌的相关分子以及调控方式,为乳腺癌肺转移的基础和实验研究提供靶点。方法：(1)人乳腺癌细胞株MDA-MB-231与V2M4细胞总蛋白与MMP1特异性抗体做免疫共沉淀,寻找与MMP1直接作用的蛋白；质谱分析所有免疫共沉淀蛋白并行western验证发现其中高低转移株的差异蛋白(ACTA2);(2)以实时定量PCR检测相关蛋白mRNA水平变化；(3)以激光共聚焦证明细胞内MMP1与ACTA2蛋白确实存在结合；(4)以蛋白表达证明及Pull down实验表明蛋白相互作用的直接性；(5)构建ACTA2基因沉默质粒并稳定转染V2M4,进一步做western及实时定量PCR检测MMP1的表达；进行细胞侵袭实验及增殖实验,三维凝胶实验；免疫缺陷鼠乳房垫注射后观察体内成瘤及肿瘤肺转移情况；(6) ACTA2病毒过表达载体构建,MDA-MB-435及MDA-MB-231转染,流式细胞仪筛选稳定转染细胞,并行ACTA2基因沉默质粒构建并稳定转染V2M4进一步做western及实时PCR检测MMP1表达情况,行细胞侵袭实验及增殖实验,三维凝胶实验；(7)利用含钙及无钙DMEM培养基检测钙对MMP1分泌的影响；(8)构建肌动蛋白特异性载体(pro-50)检测ACTA2聚合与解聚对MMP1分泌的影响；筛选钙特异性配体门控通道,得到TRPV6表达差异；(9)构建TRPV6基因沉默载体并稳定转染Vb行体内体外实验证明钙通道对MMP1分泌的影响；以TRPV6的兴奋剂与抑制剂进一步验证实验结果。结果：(1)V2M4和MDA-MB-231经过MMP1免疫共沉淀与质谱分析,得到六相互作用蛋白：GRP75/GRP78/HSP70/ACTA2/ACTB/βtublin;(2)六种蛋白中ACTA2的mRNA表达及蛋白表达的水平在V2M4与MDA-MB-231中有1000倍以上的差异,其他5个相互作用的蛋白在V2M4与MDA-MB-231均无显著性差异；(3)激光共聚焦实验表明,ACTA2在V2M4中呈弥散性分布,在MDA-MB-231中呈现细胞核内聚积分布,ACTA2与MMP1在V2M4中有明显的重叠分布,在MDA-MB-231细胞中分布无明显的重叠区域；(4)在细菌中成功表达人源GST-ACTA2,并通过pull-down实验中与外源性MMP1可相互沉淀；(5)成功构建ACTA2基因沉默细胞株V2M4-shRNA380与shRNA1126,行western blot检测,结果表明ACTA2基因沉默会大幅下调ACTA2的mRNA及蛋白水平表达,并大幅下调细胞上清中MMP1的分泌水平,但不影响细胞浆中MMP1的mRNA水平及蛋白水平的表达；(6) ACTA2基因沉默细胞比MDA-MB-231细胞三维凝胶实验中对Ⅰ型胶原的侵蚀明显增强,但细胞本身的侵袭实验没有差异,增殖实验也没有差异；(7)以V2M4在无钙与含钙培养基中培养24h后,含钙培养基中MMP1正常分泌,无钙培养基中无分泌；(8)EEED-pro-50中细胞培养MMP1明显高于DEDE-pro-50,这种作用可以被Bredfelin A抑制；以实时定量PCR确定V2M4细胞与MDA-MB-231中TRPV6与TRPV1有差异,其中Vb与MDA-MB-231比较,TRPV6的RNA表达有1000倍以上差异；(9) TRPV6基因沉默稳定转染细胞株以及激动剂、抑制剂实验均支持TRPV6对MMP1分泌起主动调控作用。结论：(1)明确了MMP1分泌与ACTA2表达直接相关；(2) MMP1分泌与ACTA2聚合与解聚相关；ACTA2调控MMP1分泌必须通过内质网与高尔基体；(3)ACTA2在自然状态中对MMP1的调控作用高度依赖于钙离子通道,其中TRPV6最为重要。第三部分MMP1/ACTA2/PAR1通路轴与临床病例T分级高度相关目的：建立MMP1/ACTA2/PAR1通路轴,为乳腺癌肺部晚期转移的靶向治疗开辟新的途径。方法：收集260例复旦大学附属肿瘤医院2002-2008年度病人原位肿瘤切除后标本,提取RNA、测定mRNA质量并行逆转录；按照TNM分期方法将病例标本分为T1组、T2组和T3组；以实时定量PCR方法检测标本中MMP1、ACTA2、PAR1、TRPV6的rnRNA表达水平。结果：三组标本中,MMP1、ACTA2、PAR1、TRPV6的mRNA表达水平无显著差异；利用delta-ct加和法统计后有显著差异；TRPV6表达在三组标本中接近一恒定值,均高于正常标本与良性肿瘤标本。结论：MMP1/ACTA2/PAR1/TRPV6为MMP1分泌轴,其中MMP1对于肿瘤体积增长起决定性作用,MMP1/ACTA2/PAR1轴有广泛的临床意义。