本学位论文基于桔小实蝇转录组数据,筛选、鉴定出了了桔小实蝇5个胰蛋白酶基因(BdTryl、BdTry2、BdTry3、BdTry4 和 BdTry5)、2个天冬氨酸酶基因(BdAspl、BdAsp2)和2个羧肽酶基因(BdCPl、BdCP2)的全长cDNA序列,在序列分析的基础上,利用qPCR技术重点解析了这些在桔小实蝇不同发育阶段、取食前后以及受胰蛋白酶抑制剂和高效氯氰菊酯胁迫处理后的应激表达模式,同时,在蛋白水平对相关酶活性进行了检测。研究结果将有助于明确桔小实蝇蛋白酶基因的功能及其调控机制,为桔小实蝇的持续防控提供新的思路和方法。主要研究结果如下：1.桔小实蝇9个蛋白酶基因的表达模式分析1.1.桔小实蝇9个蛋白酶基因在不同发育阶段的表达模式分析利用qPCR技术分析桔小实蝇9个蛋白酶基因在幼虫阶段第一、三、五天,蛹和成虫期的mRNA表达水平。结果显示,这9个基因的表达高峰均出现在孵化后3-5 d的幼虫期,化蛹后表达量迅速下降并维持在较低水平；羽化后这些蛋白酶基因的表达量逐渐上升。总体来看,9个蛋白酶基因的表达量在幼虫期最高,成虫期次之、卵期最低,推测这些基因的表达与桔小实蝇幼虫、成虫期的取食行为有密切的关系。1.2.桔小实蝇9个蛋白酶基因在胰蛋白酶抑制剂处理后的表达模式分析利用qPCR技术分析在胰蛋白酶抑制剂处理后桔小实蝇9个蛋白酶基因在成虫中肠的表达情况。结果表明,经抑制剂TLCK (100μg/mL)的处理,9个蛋白酶基因除ASP1外,均出现了2倍以上的上调,而同浓度的SBTI对各基因的影响并不明显,5个胰蛋白酶基因中只有Try3和Try4出现了显著的上调,而其余4个基因只有CP2和ASP2基因出现上调。表明桔小实蝇受到胰蛋白酶专性抑制剂胁迫时,体内蛋白酶基因的表达出现了上调的情况,以此抵御抑制剂对虫体的影响。1.3.饥饿及饲喂条件下桔小实蝇9个蛋白酶基因的表达模式分析以桔小实蝇饥饿24 h后相关基因的表达量作为对照,分析饲喂后,胰蛋白酶基因24 h内表达量的阶段性变化,结果表明,除了Try3外,其他基因均在饲喂6h后出现显著的上调,而在12至18 h的时间段出现表达高峰,随后在24 h以后出现显著的回落。此外,羧肽酶基因也在饲喂18h后出现了2倍以上的上调现象。推测桔小实蝇对食物的消化高峰出现再取食后18h,并且由胰蛋白酶和羧肽酶等共同参与,是一个多种蛋白酶协同作用的过程。1.4.高效氯氰菊酯胁迫下桔小实蝇5个胰蛋白酶基因表达模式分析为明确逆境胁迫对桔小实蝇蛋白酶影响,对高效氯氰菊酯胁迫后桔小实蝇5个胰蛋白酶基因的表达模式进行了检测。结果表明,5个胰蛋白酶基因在胁迫后均出现不同程度的上调,上调倍数介于1.5-2.3倍不等。说明桔小实蝇会提高体内的能量代谢来抵御逆境的胁迫。2.桔小实蝇胰蛋白酶活性及总蛋白酶活性的测定2.1.桔小实蝇胰蛋白酶活性的测定以BApNA为底物,测定桔小实蝇不同发育阶段以及不同组织的胰蛋白酶活性。结果表明,在桔小实蝇幼虫、蛹和成虫3个发育阶段中,幼虫期的胰蛋白酶活性最高；在幼虫的3个组织中(表皮、中肠和脂肪体),中肠胰蛋白酶活性最高。说明桔小实蝇胰蛋白酶主要在幼虫的中肠发挥作用。2.2.高效氯氰菊酯胁迫下桔小实蝇胰蛋白酶活性测定以含0.33μg/g高效氯氰菊酯的饲料饲喂桔小实蝇幼虫5d后,分别以BApNA和TAME为底物检测幼虫中肠胰蛋白酶的酯水解活性和酰胺水解活性。结果显示,在高效氯氰菊酯的胁迫下,幼虫胰蛋白酶的酯水解活性和酰胺水解活性都显著升高。说明桔小实蝇受到药剂胁迫后体内消化酶活性出现了增强。2.3.蛋白抑制剂处理后桔小实蝇胰蛋白酶及总蛋白酶活性测定以含100μg/mL胰蛋白酶专性抑制剂TLCK和SBTI的饲料饲喂刚羽化的成虫5d,测定成虫中肠的胰蛋白酶及总蛋白酶活性。结果显示,抑制剂处理后成虫中肠的胰蛋白酶酶活被显著抑制,且抑制率达到70%。但是,总蛋白酶活性却保持恒定。说明桔小实蝇在受到胰蛋白酶抑制剂胁迫时,通过其它蛋白酶活性的提高来弥补胰蛋白酶活性的损失,从而使总的蛋白酶活性维持在一个相对恒定水平。