论文部分内容阅读
背景和目的： 精神分裂症是一种发病机制尚不明确的严重的精神障碍。精神分裂症病人的影像学及尸检结果发现，部分病人存在脑白质结构的破坏，提示精神分裂症可能与脑白质损伤有关。双环己酮草酰二腙（ Cuprizone， CPZ）是一种铜离子螯合剂，可以引起少突胶质细胞（Oligodendrocytes，OLs）减少及髓鞘脱失，也可以导致动物出现类似精神分裂症病人的行为学改变。因此，C P Z暴露小鼠被用作精神分裂症的新型动物模型，探讨白质损害导致精神分裂症样行为的神经生物学机制。本实验目的为观察抗氧化剂 N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）对CPZ暴露导致的动物行为和神经生物学改变的作用，并探讨其作用机制。NAC已经用于精神分裂症的辅助治疗，我们假设该药可能通过抗氧化和抗炎机制减轻脑白质损伤，改善动物行为。 材料和方法： 雄性6周龄C57BL/6小鼠60只，随机分为5组，每组12只，分别为：1）正常对照组，该组动物腹腔注射生理盐水，每天一次，持续两周，动物食用标准饲料和饮用自来水，2） NS+CPZ组，该组动物腹腔注射生理盐水，每天一次，持续两周，期间第5-14天食用含铜腙（0.2％，w/w）的饲料，3）NAC（L）+CPZ组，该组动物腹腔注射NAC（100 mg/kg/day），每天一次，持续两周，期间第5-14天食用含铜腙（0.2%，w/w）的饲料，4）NAC(M)+CPZ组，该组动物腹腔注射NAC（200 mg/kg/day），每天一次，持续两周，期间第5-14天食用含铜腙（0.2%，w/w）的饲料，5）NAC(H)+CPZ组，该组动物腹腔注射NAC（400 mg/kg/day），每天一次，持续两周，期间第5-14天食用含铜腙（0.2%，w/w）的饲料。最后一次腹腔注射后24小时，进行动物行为学测试，顺序为旷场实验-社交行为实验-Y-迷宫实验。行为学实验结束后，每组半数动物(6只)在深麻醉状态下（戊巴比妥钠，80 mg/kg,腹腔注射）取肝脏组织，并分离出大脑皮质（CTX），尾壳核（CPU）和海马（Hip），检测T-SOD、GSH-Px、H2O2、MDA含量，做酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的浓度。余下每组6只小鼠在深麻醉状态下灌注固定取脑，用免疫组织化学及免疫荧光方法检测小鼠脑组织少突胶质细胞（GST-Pi阳性细胞）、髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）及小胶质细胞(Iba-1阳性细胞)的变化。采用Excel2007和SPSS21.0统计软件分析数据，结果以均数±标准误（Means±SEM）表示。采用单因素方差分析。组间两两比较之前进行方差齐性检验，方差齐则采用Tukey HSD检验，方差不齐采用Dunnett T3检验。P＜0.05定义为差别具有统计学意义，P＜0.01定义为差别具有显著统计学意义。 结果： 1. CPZ短期暴露对小鼠行为学的影响以及N-乙酰半胱氨酸的干预作用 1.1.旷场实验：5组小鼠的总路程、中央路程、中央路程/总路程之比，以及在中央区活动的时间均无统计学差异(P＞0.05)。 1.2.社交行为实验：5组小鼠均能区分空笼及笼内存在不熟悉同类的情况，因为它们在笼子里有目标小鼠的情况下比空笼状态下在笼周活动更长的时间。但是各组之间无差别。 1.3. Y-迷宫实验：5组小鼠的入臂次数差别没有统计学意义(P＞0.05)。NS+CPZ组小鼠的自发交替率低于Control组（P＜0.05），但是，经NAC处理的CPZ暴露小鼠未见这种异常行为，它们与正常组比较无差别。 2. CPZ短期暴露对小鼠组织中氧化应激指标的影响以及N-乙酰半胱氨酸的干预作用 2.1. T-SOD活力检测：在CTX和肝脏组织，NS+CPZ组与Control组比较，T-SOD活力降低（P＜0.05），而经NAC处理的CPZ暴露组T-SOD的活力与Control组没有差别。在CPU和Hip脑区，5组T-SOD活力差别没有统计学意义。 2.2. GSH-PX活力检测：在CTX、CPU、Hip3个脑区，5组GSH-PX活力检测结果均无统计学差异(P＞0.05)。 2.3. H2O2检测：在CTX、CPU、Hip脑区和肝脏，5组H2O2检测结果均没有统计学差异(P＞0.05)。 2.4. MDA检测：在CTX、Hip、和肝组织，NS+CPZ组MDA含量高于对照组，但是NAC处理组与对照组无差别。在CPU脑区，5组MDA检查结果无统计学差异。 3. CPZ短期暴露对小鼠脑内IL-1β和TNF-α的影响以及N-乙酰半胱氨酸的干预作用 3.1. IL-1β：在CTX，NS+CPZ组高于对照组（P＜0.05），但是在NAC（H）未见此种变化。在CPU和Hip，NS+CPZ组高于对照组（P＜0.05、P＜0.01），而经低、中、高剂量的NAC处理的CPZ暴露组均与对照组IL-1β没差别，较NS+CPZ组降低。 3.2. TNF-α：在CPU和Hip， NS+CPZ组TNF-α的含量高于对照组（P＜0.05、P＜0.01），而低、中、高剂量的NAC均能缓解CPZ引起的TNF-α增高。在CTX，5组TNF-α的含量差别没有统计学意义； 4. CPZ短期暴露对小鼠小胶质细胞的影响以及N-乙酰半胱氨酸的干预作用 利用能特异性地识别小胶质细胞的抗体（Iba-1），我们实施了免疫荧光染色识别并利用Image-Pro Plus6.0(IPP6.0)软件计数Iba-1阳性细胞。在CC、CPU、CTX、和海马CA1、CA3、DG区，NS+CPZ组比对照组有更多的Iba-1（+）细胞（p＜0.01），而且它也比NAC（L）和NAC（H）组的该指标显著增多（p＜0.01）。 5. CPZ短期暴露对少突胶质细胞及髓鞘碱性蛋白的影响以及N-乙酰半胱氨酸的干预作用 利用能特异性地识别成熟少突胶质细胞（GST-Pi抗体）和髓鞘（MBP抗体）的抗体，我们实施了免疫组织化学染色并利用Image-Pro Plus6.0(IPP6.0)软件进行定量分析。在CC、CPU、CTX和海马CA1、CA3、DG区，NS+CPZ组比对照组有更少的GST-Pi（+）阳性细胞数（P＜0.01），而且它也较NAC（L）和NAC（H）组的该指标显著减少（P＜0.01）。以上脑区的MBP免疫组织化学染色分析结果5组之间差别均无统计学意义。 结论： 1. CPZ暴露10天对小鼠的空间工作记忆有损害，NAC处理对CPZ引起的空间工作记忆损害有改善作用。 2. CPZ暴露10天引起小鼠CTX及肝脏组织T-SOD降低，NAC处理缓解了CPZ引起的T-SOD降低。CPZ暴露导致小鼠大脑皮层、海马及肝脏组织MDA升高，NAC处理阻断了CPZ引起的MDA增加。 3. CPZ暴露10天导致小鼠脑内小胶质细胞数目增多，脑内炎性细胞因子IL-1β、TNF-α含量增多，NAC处理减轻了这些神经炎症反应指标。 4. CPZ暴露10天导致少突胶质细胞数目减少，NAC处理减轻了这种变化。 以上结果表明，CPZ短期暴露导致少突胶质细胞减少并损害小鼠的空间工作记。NAC可能通过抗氧化和抗炎作用保护OLs并缓解动物的工作记忆损害。本研究结果为NAC用于精神分裂症的辅助治疗提供了一种神经生物学解释。