研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)主要累及65岁以上的老年人,临床上主要表现为以记忆力减退为首发症状的进行性认知功能减退、精神行为的异常,并伴有日常生活能力的丧失。AD病因及发病机制目前尚不明确。近年大量研究结果显示除β-淀粉样蛋白沉积、神经纤维缠结及神经元丢失外,胰岛素信号通路的异常亦是AD的一种早期病理改变。胰岛素信号通路在脑内葡萄糖代谢、神经递质转运、学习记忆的形成及抗凋亡作用等方面起着重要作用。而且越来越多的证据表明AD脑内海马中存在胰岛素信号通路的异常,包括胰岛素受体的表达下调及内陷、胰岛素受体底物-1(Insulin Receptor Substrate-1, IRS-1)抑制性的丝氨酸磷酸化及蛋白激酶B(Protein Kinase B, PKB/AKT)丝氨酸473位点磷酸化基础水平的升高等。亦有流行病学研究数据显示,与非2型糖尿病(Type Two Diabetes Mellitus, T2DM)患者相比,T2DM患者发生遗忘型或非遗忘型轻度认知功能障碍的风险增加了2.5倍,并可以加速AD患者认知功能障碍的进展,且老年人高胰岛素血症及胰岛素抵抗与其认知功能的损害呈负相关。此外,AD患者早期即可出现高胰岛素血症及CSF中胰岛素水平的降低。因此推测AD患者中胰岛素抵抗可能对AD病理进程的发生发展起着重要的推动作用。而胰岛素鼻腔给药在AD临床患者的治疗作用进一步证实了这一推论。近年几项关于AD患者鼻腔胰岛素给药的随机、对照试验证实胰岛素可显著改善AD患者的认知功能、降低血液中Aβ的水平,并可改善AD患者脑内的葡萄糖代谢。此外,动物试验证实胰岛素可降低脑内Aβ沉积。因此胰岛素信号通路异常在AD发生发展中的作用毋庸置疑。但胰岛素信号通路不仅广泛分布于神经元,在星形胶质细胞也有表达。但以往关于AD胰岛素抵抗的研究多集中于神经元,AD中星形胶质细胞胰岛素信号通路的改变及其作用鲜有报道。星形胶质细胞是中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)的重要组成细胞,占脑部总体积的近50%,是神经元细胞数的6倍。星形胶质细胞在脑内能量代谢、神经递质清除、抗氧化及维持水、电解质平衡等方面发挥着不可或缺的作用。多项研究结果显示胰岛素信号通路参与星形胶质细胞的谷氨酸摄取、抗氧化及葡萄糖代谢等多种生理过程的调控。特异性表达于星形胶质细胞上的谷氨酸转运体-1(Glutamate Transporter-1, GLT-1)负责脑内90%以上兴奋性谷氨酸的摄取。而胰岛素干预可促进星形胶质细胞上GLT-1的表达及其在细胞膜的分布。此外,星形胶质细胞对神经元的抗氧化保护作用必须依赖于胰岛素／胰岛素样生长因子-1。更重要的是星形胶质细胞是成人脑内唯一能储备糖原的神经细胞,而糖原是脑内唯一的能量储存形式。大量数据证实糖原是低血糖或神经元持续、高度兴奋时神经元的主要能量来源,对学习记忆的形成至关重要。而胰岛素可以通过PI3K/Akt途径促进星形胶质细胞内糖原的合成。因此,明确AD中是否存在星形胶质细胞胰岛素信号通路的异常及对其功能的影响十分重要。Aβ1-42是AD脑内老年斑的主要组成成分,由淀粉样前体蛋白酶解后产生。AD脑内Aβ1-42聚集后形成寡聚体Aβ1-42或纤丝状Aβ1-42,而寡聚体Aβ1-42在AD脑内最具神经元毒性,可以导致神经元胰岛素信号通路的损害、突触损伤及学习记忆障碍。因此,寡聚体Aβ1-42是目前AD造模首选的干预方法。研究目的1、明确Ap1-42寡聚体对星形胶质细胞胰岛素信号通路的影响；2、探讨Aβ1-42寡聚体介导星形胶质细胞胰岛素信号通路损害的机制。研究方法1、人星形胶质细胞的培养：人原代星形胶质细胞细胞系HA-1800购自美国ScienCell Research Laboratories。使用含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、 100U/ml青霉素及0.1mg/ml链霉素的低糖DMEM培养基,置于37℃、含5% C02的细胞培养箱中对细胞进行常规培养。根据细胞生长情况适时进行细胞传代、冻存或处理。传代后24h内避免移动培养瓶,以保证细胞充分贴壁。传代或冻存前24h内换液,以保证细胞处于良好的生长状态。一般3天传代一次,隔天换液一次。2、Aβ1-42寡聚体的制备与鉴定：本实验中Aβ1-42寡聚体的制备主要参照纽约Rochester医学中心William J.Bowers教授制备方法所进行的。简而言之,在生物安全柜中使用气密注射器将222μL六氟异丙醇(hexafluoroisopropanol, HFIP)加入室温平衡后的粉末状Aβ,充分混匀,得到浓度为lmmol/L均质的Aβ-HFIP溶液。HFIP完全挥发,得到Aβ1-42的肽膜。然后加入适量的无水二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO),充分振荡混匀、超声浴10分钟后得到5mmol/L的Aβ-DMSO溶液。接着加入冰上预冷的PBS+0.05%SDS,并充分振荡30s,然后置于4℃冰箱内孵育24h。继而加入适量PBS将其稀释得到浓度为50μg/mL(11.1μM)的溶液,4℃冰箱继续孵育2周,得到浓度为11.1μM的Aβ1-42寡聚体。制备好的寡聚体可置于-80℃冰箱内保存。透射电镜的方法对制备的Ap进行鉴定。根据实验需要,使用DMEM培养基将11.1μM的Aβ1-42寡聚体进行稀释。每次使用前4℃、13,000rpm离心10分钟,去除杂质。3、采用western blot方法检测不同干预条件下星形胶质细胞内Akt总蛋白、P-Akt Ser473、IRS-1总蛋白、P-IRS-1 Ser636/639、ERK1/2总蛋白及P-ERK1/2的水平变化。各抗体使用的浓度分别为：P-ERK1/2 (Thr202/Tyr204),1:6000; ERK1/2,1:6000; P-IRS-1 Ser636/639, 1:1000; IRS-1,1:1000; P-Akt Ser473,1:1000; Akt,1:1000? α-tubulin,1:2000。4、采用免疫荧光共聚焦的方法检测细胞内P-IRS-1 Ser636/639的表达水平及其在细胞内的分布,采用免疫荧光的方法检测细胞内P-GSK Ser9及P-GSK Tyr216的表达水平。各抗体的使用浓度均为1：50。5、采用PAS染色及糖原检测试剂盒的方法检测不同干预条件下细胞内糖原的含量。6、统计学分析：应用SPSS (17.0)进行数据的统计分析。定量数据用均数±标准差(X±S)进行表示。Western Blot条带采用Image J软件进行灰度分析。目的条带灰度值经对应的内参调整后,计算磷酸化蛋白与总蛋白的比值,同时将正常对照组磷酸化蛋白／总蛋白的比值设定为1,然后进行统计分析。两组间均数的比较采用t检验,多组间均数的比较采用方差分析。当P值小于0.05时差异有统计学意义。结果1、与NC组比较,胰岛素处理30min后星形胶质细胞内Akt Ser473位点的磷酸化水平升高,且存在浓度依赖性,胰岛素100nM处理组P-Akt Ser473的水平升高最明显,与NC组比较有显著性差异(P<0.05)；但与NC组比较,不同胰岛素浓度处理组Akt总蛋白水平无明显改变。100nM胰岛素处理30min后星形胶质细胞内GSK3β Ser9位点的磷酸化水平显著升高,而GSK3β Tyr216位点的磷酸化水平显著降低；同时,糖原检测试剂盒及PAS染色的结果显示胰岛素处理条件下细胞内糖原储存亦明显升高(P<0.05)。2、与胰岛素组比较,1μM Aβ1-42寡聚体可抑制星形胶质细胞内Akt Ser473位点的磷酸化,且存在时间依赖性,24h处理组P-Akt Ser473水平降低最明显,与胰岛素组比较有显著性差异(P<0.05)；但与胰岛素组比较,不同时相Aβ1-42寡聚体处理组Akt总蛋白水平无明显变化。1 μM Aβ1-42寡聚体处理24h后,星形胶质细胞内GSK3β Ser9位点的磷酸化水平明显降低,而GSK3β Tyr216位点的磷酸化水平明显升高；同时伴有细胞内糖原储存的减少。3、与NC比较,1μM Aβ1-42寡聚体可以介导星形胶质细胞内ERK1/2的磷酸化,干预3h时ERK1/2磷酸化水平升高最明显(P<0.05),6h、9h、12h、24h于预组其磷酸化水平逐渐降低,至24h时恢复至基线水平；但与NC组比较,1 μMAβ1-42寡聚体各时相干预组ERK1/2总蛋白水平无明显改变。与NC组比较,1μM Aβ1-42寡聚体处理3h后,星形胶质细胞内ERK1/2及IRS-1 Ser636/639位点蛋白磷酸化水平均显著升高(P<0.05),但ERK1/2及IRS-1总蛋白水平无明显改变。免疫荧光共聚焦的结果与western blot结果一致,且Aβ1-42寡聚体介导的磷酸化IRS-1 Ser636/639主要分布于细胞核内。4、PD98059是ERK1/2特异性上游激酶抑制剂。与Aβ1-42寡聚体干预组比较,PD98059预处理1h可显著抑制Aβ1-42寡聚体介导的ERK1/2及IRS-1 Ser636/639位点的磷酸化(P<0.05),但ERK1/2及IRS-1总蛋白水平无明显改变。5、与Aβ1-42寡聚体干预组比较,PD98059预处理1h后,星形胶质细胞内Akt Ser473位点及GSK3β Ser9位点的磷酸化水平显著升高,而GSK3β Tyr216位点的磷酸化水平显著降低。同时伴有细胞内糖原储存的显著增高。结论上述实验结果提示胰岛素可以促进星形胶质细胞内胰岛素信号通路的活化,而Aβ1-42寡聚体可以抑制胰岛素刺激条件下星形胶质细胞内胰岛素信号通路的活化及细胞内糖原的储存。ERKl/2特异性上游激酶抑制剂PD98059对这一效应的逆转作用提示Aβ1-42寡聚体介导的星形胶质细胞胰岛素信号通路的损害可能与ERK1/2依赖的IRS-1Ser636/639位点的磷酸化有关。但星形胶质细胞胰岛素信号通路的损害及其在AD发生发展中的作用有待进一步深入研究。