论文部分内容阅读
目的: 采用HRM技术建立一种快速、简便检测BRAF基因T1799A突变的实验方法，并应用于甲状腺肿瘤的检测，初步探讨其临床应用价值。 方法: 1.根据已知的BRAF基因T1799A突变的位点信息，用Primer Premier5.0软件设计定点突变特异性引物，采用高保真PCR扩增含有野生型突变基因的片段，并通过定点突变方法获取突变型基因片段。同时采用TA克隆技术获得野生型和纯合突变型的质粒载体用于HRM检测体系的模板和基因分型对照。 2.通过优化反应体系建立HRM技术检测BRAF基因T1799A突变的方法，并进行方法学评价。 3.收集176例临床甲状腺肿瘤患者组织标本，采用HRM技术检测BRAF基因T1799A突变，并与双向基因测序结果比对，探讨其初步的临床应用价值。 结果: 1.以正常人基因组DNA为模板，采用定点突变后成功引入BRAF基因中T-1799-A的基因突变，经测序比对验证分析，获得含有野生型BRAF基因T1799A突变片段和纯合突变型BRAF基因T1799A突变片段的质粒。 2.用分别含BRAF基因T1799A突变野生型与纯合突变型基因片段的质粒DNA作为HRM检测体系的模板与基因分型对照，通过体系优化建立了快速、简便的BRAF基因T1799A突变的HRM检测方法;批内、批间的重复性实验结果表明，野生型、杂合型、纯合突变型的Tm值和Ct值的变异系数均小于5％;该检测体系可以对浓度范围1pg到100ng的DNA模板进行基因分型;检测突变杂合比例能力的结果显示可以检测出不低于25％的突变。 3.176例甲状腺肿瘤患者组织标本进行BRAF基因T1799A突变检测，结果显示甲状腺恶性肿瘤组检出57.3％的突变率，对照组甲状腺良性病变中均无此突变，与测序所得基因型结果完全相符;两组基因突变率比较具有统计学意义(P＜0.001)。 结论: 1.采用定点突变的方法和TA克隆技术成功克隆了含有BRAF基因T1799A突变片段的野生型与纯合突变型质粒，为后续HRM技术检测该基因突变的方法提供了模板与基因分型对照。 2.利用HRM分析技术，建立了一种快速、简便、灵敏、特异的适用临床检测BRAF基因T1799A突变的方法，为该突变相关的临床疾病的诊断、治疗等提供可选择的实验室工具。 3.BRAF基因T1799A突变检测结果显示该突变与甲状腺恶性肿瘤有相关性，可作为今后甲状腺肿瘤的临床诊断指标。该HRM技术检测BRAF基因T1799A突变的方法能进行基因分型，可在今后结合FNAB检查，为甲状腺肿瘤临床诊断提供辅助检查。