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酯酶(EC3.1.1.x)是能够催化一系列酯键生成相应的酸和醇的重要生物催化剂。其在有机溶剂中有较好的稳定性、活性及立体选择性,因此被广泛用于合成食品添加剂、农用化学品和医药中间体等重要化合物。在本课题中,我们采用分子克隆手段,从大肠杆菌K-12中克隆表达出一系列的酯酶并且研究其性质。另外我们通过定向进化对该类酶进行改造,获得了立体选择性得到明显提高的酯酶。通过GenBank数据库分析,从大肠杆菌K-12中筛选了酯酶基因,经PCR扩增后,获得了31个不同的酯酶基因片段,用内切酶双酶切后,与经过相同的限制性内切酶切割的载体pET-30a(+)连接,转化到大肠杆菌BL21中。重组菌在IPTG的诱导下表达,经过SDS-PAGE分析后,获得了相应的目标蛋白。建立了一种结合酯酶活性与立体选择性的高效筛选策略。以4-硝基苯丁酸酯为活性筛选的底物,通过检测405nm下的吸光度,获得了5个活性较好的酯酶(XL3,XL10, XL15,XL27,XL31).再以1-乙酸苯乙酯作为底物进行立体选择性筛选,以1 mmol/L溴百里香芬兰作为指示剂,利用酶标仪在630 nm下检测各个酶催化水解反应中吸光度的变化,获得了对1-乙酸苯乙酯具有较高立体选择性的酯酶XL15。利用1-乙酸苯乙酯的水解反应和酯化反应对XL15进行复筛,转化率分别达到31.2%和36.8%,其对映体选择性(E值)均大于100。在对克隆获得酯酶的酶学性质的研究中发现,对于短链4-硝基苯酯,上述5个酯酶均具有较高的活性,但对于长链4-硝基苯酯,酶的活性明显下降。不同的酶的最佳反应pH值和反应温度亦不同。通过对酯酶XL15进行诱导表达条件的优化,获得了最佳蛋白表达条件：IPTG浓度为0.1mmol/L,诱导前菌体生长量为OD600=0.7,诱导温度为30℃。进一步对酯酶XL15进行蛋白纯化,获得了大小为28kDa的目标条带。通过序列分析与比对,XL15属于α/β/α水解酶结构,具有典型的Ser-His-Asp活性位点。初步预测表明,其活性中心附近存在一个类似“口袋”的结构,对于R-乙酸苯乙酯,手性碳上苯环的指向使得甲基能够比较好地契合到小口袋中,从而使该酶具有对R-乙酸苯乙酯较好的立体选择性。为了提高酯酶的立体选择性,我们采用了定向进化手段。所研究的酶为来自红球菌Rhodobacter sphaeroides的RSP 2728酯酶。整个过程中,我们建立了有效的定向进化策略和高通量筛选方法。利用易错PCR技术,进行了四轮突变,获得了突变株A6A5, B7F11, C8G1和D3E11,在对扁桃酸甲酯的水解反应中,其立体选择性相比较于野生菌株,对映体选择率(E值)从3.1分别提高到5.3,8.8,14.0和30.8；活性相对于野生菌株,从10U/mg分别提高到43 U/mg,142U/mg,88 U/mg和24 U/mg。序列分析表明,突变体A6A5的62位上的氨基酸发生了突变,由原先的天冬酰胺变成了酪氨酸；突变体B7F11的62位上的氨基酸由天冬酰胺变为了酪氨酸,145位上的亮氨酸变成了组氨酸；突变体C8G1的62位上的氨基酸由天冬酰胺变为了半胱氨酸,145位上的亮氨酸变成了组氨酸；D3E11的62位上的氨基酸由天冬酰胺变为了半胱氨酸,121位的甲硫氨酸变成了颉氨酸,145位上的亮氨酸变成了组氨酸。由此可见,利用定向进化策略能够有效地提高酶的立体选择性。