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雪莲PEBP基因是本实验室分离出的新抗寒相关基因,共有510个核苷酸,网上进行BLAST对比,与拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的磷脂酰乙醇胺结合蛋白基因类似,相似性81%。本实验以实验室构建的Teasy-PEBP质粒为模板,扩增PEBP基因,克隆到表达载体pET30(+)和pPIC9k并导入大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞内表达,纯化表达产物,优化表达条件,主要结果如下:根据pET30(+)多克隆位点设计PEBP基因特异性引物,引入EcoRⅠ和NcoⅠ酶切位点,以Teasy-PEBP质粒为模板,扩增PEBP基因,连接到原核表达载体pET30(+)上,转化感受态表达菌株BL21(DE3),在低温下,低浓度IPTG诱导融合蛋白表达,纯化表达产物,Western blot鉴定目的蛋白,SDS-PAGE分析:其相对分子量约为28KD,与预期相符,表达量约占菌体蛋白的26.8%,并且通过亲和层析纯化了重组融合蛋白,Western blot鉴定为阳性。根据pPIC9k多克隆位点设计PEBP基因引物,分别加入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点,以Teasy-PEBP质粒为模板,扩增PEBP基因,克隆到表达载体pPIC9k,得到重组质粒并命名为pPIC9k-PEBP,将pPIC9k-PEBP用SalⅠ进行酶切,线性化后的pPIC9k-PEBP以电转化法导入到酵母GS115细胞中,利用MM和MD平板筛选Mut~s(methanol utilization slow)表型,PCR鉴定重组酵母菌株,乙醇诱导表达。SDS-PAGE分析:其相对分子量约为20KD,蛋白表达量可占总蛋白的90%,上清液抗冻检测表明,PEBP能降低液体的冰点,具有一定的抗冻作用。优化重组质粒pPIC9k-PEBP在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的表达条件,初步得到最佳的重组蛋白表达条件为:诱导剂甲醇浓度为0.5%,诱导培养基的PH为6.0,诱导温度为32℃,诱导时间为216h。实验成功构建了表达载体pET-PEBP和pPIC9k-PEBP,获得了高效表达产物,并为进一步研究雪莲PEBP的抗冻功能奠定基础。