一、研究背景支气管哮喘(简称哮喘)(bronchial asthma, asthma)是一种常见病、多发病,由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾患。慢性炎症对气道的持续性损伤和机体对损伤性刺激的修复性反应所引起的气道组织结构重构,造成持续性气流受限、肺功能下降、气道高反应性,从而引起一系列哮喘的临床症状。全球哮喘控制现状仍然十分严峻,有调查报告说,迄今亚太地区哮喘病的控制率仅3%,欧洲也只有5%的患者可达到哮喘控制。哮喘未控制会严重影响患者日常生活,并造成急性加重时医疗资源的占用,进而成为沉重的社会负担。然而哮喘的发病机制仍不清楚,哮喘的防治仍是一大难题。因此探讨哮喘的发病机制和寻找新的治疗靶点成为一项至关重要的任务。近年来提出哮喘的本质是气道慢性炎症,气道炎症贯穿哮喘整个病程。气道炎症涉及到炎症细胞、炎症介质、细胞因子三者的相互作用。哮喘病人气道内浸润的炎症细胞有淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞。研究证实哮喘发病机制中的主要效应细胞是嗜酸性粒细胞(eosinophil,EOS),在哮喘患者的诱导痰、支气管肺泡灌洗液、外周血中有大量的活化的EOS聚集。EOS浸润引起的气道炎症,主要与EOS活化和释放的颗粒蛋白有关,如主要碱性蛋白(major basic protein, MBP)能诱导IL-5、组胺等炎性因子的释放从而介导气道炎症。已经证实参与哮喘发病过程的细胞因子有IL、IL-13、转化生长因子β (Transforming growth factor beta,TGF-β)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)。哮喘发病过程中发挥重要角色的体细胞有气道上皮、气道平滑肌细胞、成纤维细胞,而细胞因子和炎症介质作用这些体细胞引起气道发生病理性改变,如气道上皮屏障破坏、气道重构、气道反应性增高。有关研究数据显示肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis, TWEAK)通过与其受体成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14(fibroblast growth factor-inducible immediate-early response protein14, FN14)结合后发挥多种生物学效应,包括促进炎症发生、血管生成、调节细胞生存、增殖、凋亡。TWEAK是TNF-α生长因子家族中的一员,是一种II型跨膜蛋白,能水解为长度为156个氨基酸的可溶性细胞因子发挥作用。而FN14是与TWEAK具有生物学亲和力的受体,是一种I型跨膜蛋白,包含一个富含半胱氨酸的胞外区和一个包含肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor, TRAF)结合基序的短胞内区。而TWEAK/FN14的相互作用是通过与TRAF分子结合激活两条NF-κB信号通路：Iκ B α磷酸化和P100程序化。众所周知NF-κB是免疫和炎症反应细胞内一个广泛的快速反应转录因子,通过表达细胞因子、趋化因子、细胞粘附分子、生长因子和免疫受体,在免疫球蛋白介导的疾病(如哮喘)中发挥作用。TWEAK可以在多种组织和细胞上表达,高度表达在炎症细胞,包括活化的T细胞、分叶核的白细胞、巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞、B细胞；而FN14在正常条件下表达水平相对较低,有趣的是FN14在组织损伤与修复区域、慢性炎症疾病高度表达,这也证实了TWEAK/FN14协调急性炎症中组织修复的生理性作用,而慢性炎症疾病中发挥病理性作用。既往有报道指出,TWEAK/Fn14也参与了风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、肾脏损伤、中风、神经系统炎症和变性、肿瘤、心功能衰竭的病理过程。TWEAK还可以作为一些疾病的治疗效果和早期诊断的生物标记,比如肾脏损伤,系统性红斑狼疮,动脉粥样硬化。综上,我们发现TWEAK/FN14相互作用可以调节一些组织的炎症反应。国外研究发现TWEAK/FN14相互作用能刺激人支气管上皮细胞释放IL-8, GM-CSF,加重气道的炎症,用抗FN14单抗能阻止这些炎症因子的释放。TWEAK通过激活NF-KB途径,诱导人肾脏细胞表达多种炎症调节因子,如MCP-1, IP-10, MIP-la, ICAM-1, VCAM-1,并能刺激体外与体内肾脏细胞的增殖。通过免疫组化发现在炎症性肺病患者肺组织和肺泡灌洗液中有TWEAK的表达,说明TWEAK/FN14的相互作用与肺部炎症性疾病息息相关,本研究主要探讨TWEAK/FN14在哮喘病理生理过程的作用。二、研究目的1、观察TWEAK在哮喘小鼠肺组织中的表达及分布。2、观察FN14在哮喘组小鼠肺组织中的表达及分布。3、探讨地塞米松对哮喘小鼠肺组织中TWEAK表达的调节作用。4、探讨地塞米松对哮喘小鼠肺组织中FN14表达的调节作用。三、材料和方法1、雌性BALB/C SPF级小鼠由南方医科大学实验动物中心提供。2、哮喘小鼠模型构建及分组：SPF级雌性BALB/c(?)、鼠36只随机分为正常对照组、哮喘组和地塞米松治疗组,每组12只。哮喘组于第1天和第14天腹腔及皮下注射OVA氢氧化铝混悬液0.2mL[含OVA10μg, AL (OH)3100μl]致敏,第21天开始雾化吸入50g/L的OVA溶液激发30min,每周3次,连续8周;地塞米松治疗组致敏同哮喘组,于第21d开始雾化吸入50g/LOVA,激发前30min腹腔注射地塞米松(10mg/kg);正常对照组用生理盐水代替OVA致敏和激发。3、TWEAK及其受体FN14在各组小鼠肺组织中mRNA表达：各组小鼠末次激发24h后,麻醉后结扎右侧支气管,左肺行肺泡灌洗,支气管肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid, BALF)收集离心后取上清,沉淀物涂片染色显微镜下行细胞分类计数。取右侧肺组织提取RNA后逆转录为cDNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TWEAK及FN14在各组小鼠肺组织中的表达。4、通过免疫组化检测TWEAK及其受体FN14在各组小鼠肺组织中的蛋白表达及分布：各组小鼠左侧肺组织石蜡包埋切片后,行HE染色及免疫组化检测TWEAK及FN14。用ImagePro Plus6.0软件对阳性区域的平均光密度值行图像分析(平均光密度值=积分光密度值(IOD sum)/阳性区域总面积(area sum)。5、western blot检测各组肺组织中TWEAK及FN14蛋白的表达水平。各组小鼠肺组织提取组织蛋白后,经SDS-PAGE电泳、转膜、加抗体孵育、显色后拍照,用Gel-Pro Analyzer4图像软件分析各条带灰度值,测出目的蛋白的表达强度(相对灰度值=目的蛋白表达强度/内参表达强度)。6、采用SPSS13.0统计软件进行结果分析,数据用均数±标准差(x+s)表示。两样本均数比较采用两独立样本t检验,多组均数比较采用单因素方差分析(Oneway ANOVA),组间两两比较采用LSD法；若方差不齐,采用校正的F检验(Welch法),并选用Dunnet T3法。P<0.05,p<0.01表示差异有统计学意义。四、结果1、用OVA激发后发现,哮喘组小鼠出现烦躁不安、喘息、呼吸急促、大小便失禁,对照组小鼠无异常,地塞米松组也出现哮喘组的症状,但症状较轻。2、HE染色结果,对照组气管上皮完整,管腔正常,无支气管痉挛、支气管狭窄,无炎症细胞浸润。哮喘组小鼠的支气管狭窄,管腔内可见粘液栓,支气管痉挛,粘膜下、肺泡间质中可见大量以EOS为主的炎症细胞浸润,血管周围尤为显著,气道上皮细胞脱落。较哮喘组,地塞米松组支气管粘膜上皮、管壁结构较完整,管腔有轻度破坏,以EOS浸润为主的炎症细胞明显较少。3、肺泡灌洗液细胞分析结果显示各组BALF中的细胞总数分别为：8.42+2.12,22.12+5.54,14.89+3.20,嗜酸性粒细胞数分别为：0.03+0.02,4.88±1.24,1.06±0.32,淋巴细胞数分别为：0.34±0.11,1.75±0.40,0.94±0.33。由此可见,哮喘组、地塞米松组BALF的细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞均较对照组明显增多(F=40.09,F=149.35, F=76.51, P值均小于0.01),地塞米松组较哮喘组细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞计数明显减少(F=40.09,F=149.35, F=76.51, P值均小于0.01)。4、实时定量PCR示,各组TWEAK mRNA的表达量分别为：1.01+0.10,2.35+0.12,1.52+0.12, FN14mRNA的表达量分别为：1.01+0.10,3.48+0.24,2.30±0.19。由此可以看出,哮喘组、地塞米松组小鼠肺组织中TWEAK及FN14mRNA的表达均较对照组显著升高(F=417.03, F=523.16, P<0.01),而地塞米松组较哮喘组TWEAK及FN14mRNA的表达显著降低(F=417.03,F=523.16,P<0.01)。5、免疫组化结果显示,各组TWEAK蛋白的表达量分别为：0.14+0.19,0.47±0.23,0.26±0.24,FN14蛋白的表达量分别为：0.18±0.02,0.57±0.03,0.28+0.03。由此可以看出,哮喘组、地塞米松组TWEAK的蛋白表达量较对照组有明显增加(F=672.14,P<0.01),主要表达在小鼠肺组织气道上皮细胞、肺泡上皮细胞和炎症细胞。地塞米松组TWEAK的蛋白表达量较哮喘组有明显减少(F=672.14,P<0.01)。哮喘组、地塞米松组小鼠肺组织中Fnl4蛋白的表达量较对照组明显升高(F=676.33,P<0.01),主要在小鼠肺组织气道上皮细胞、血管内皮、血管平滑肌表达,而地塞米松组FN14的蛋白表达量较哮喘组有明显降低(F=676.33,P<0.01)。6、Western blot显示,各组的TWEAK/内参灰度比值分别为：0.22+0.06,0.72±0.08,0.35±0.05；FN14/内参灰度比值分别为：0.42±0.06,1.09±0.15,0.62+0.09。哮喘组、地塞米松组TWEAK的蛋白表达量较对照组有明显增加(F=145.91,P<0.01),地塞米松组TWEAK的蛋白表达量较哮喘组有明显减少(F=145.91,P<0.01)。哮喘组、地塞米松组小鼠肺组织中Fn14蛋白的表达量较对照组明显升高(F=97.25,P<0.01),而地塞米松组FN14的蛋白表达量较哮喘组有明显降低(F=97.25,P<0.01)。五、结论：TWEAK/Fn14的相互作用参与了哮喘发病的病理生理过程,地塞米松可能通过下调它们的表达,从而降低气道的炎症反应,缓解哮喘症状。