内生真菌具有丰富的生物多样性以及次生代谢产物多样性,近年来已成为具有生物活性成分的重要来源之一,是当前农业、医疗卫生等领域的研究新热点。药用植物木豆[Cajanus cajan(L.)Millsp.]是豆科木豆属一年生或多年生灌木,具有清热、解毒、抑菌、消炎等功能,表现出较强地挖掘新型内生真菌的潜力。本研究从木豆中分离得到内生真菌,经过抗植物致病菌活性筛选及LC-MS/MS检测,获得三株特异性产黄柄曲霉素的木豆内生真菌,并对其进行形态学及分子生物学鉴定。同时,以黄柄曲霉素为指标,选取菌株ELP-8-9进行发酵培养基组成和培养条件优化,从而进一步分离纯化木豆内生真菌ELP-8-9中的黄柄曲霉素,并对真菌源黄柄曲霉素抑制尖孢镰刀菌以及大豆根腐病的活性进行研究,研究结果如下:1、首次从木豆中分离得到三株特异性产黄柄曲霉素的内生真菌,并对其进行了系统的分类鉴定;对木豆的根、茎、叶、花、豆荚及种子中的内生真菌进行分离,共得到156株木豆内生真菌。经过初步活性筛选,发现其中29株内生真菌至少对一种植物病原菌有抑制作用(抑制率达50%以上),占测试总株数的18.59%。对活性菌株的发酵代谢粗提物进行抗植物致病菌活性复筛,最终获得抑制植物致病菌活性较好的菌株ELP-5-3、ELP-7-7、ELP-8-9、ELP-9-2、ELP-17-1、ESP-10-2、ERP-11-4。通过 LC-MS/MS 定向筛选出三株特异性产黄柄曲霉素的木豆内生真菌ELP-7-7、ELP-8-9和ELP-9-2,对上述三株内生真菌进行了形态学鉴定及分子生物学鉴定,结果表明此三株菌均属于毛壳属的球毛壳菌(Chaetomium globosum)。2、通过对发酵培养基组成及培养条件进行优化,确定了内生真菌ELP-8-9最佳发酵工艺条件;考察了不同的因素对内生真菌ELP-8-9黄柄曲霉素产量的影响,主要包括不同的发酵培养基、碳源、氮源、培养时间、培养温度以及初始pH值等。结果表明最优发酵培养基为:马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB),碳源为2%的葡萄糖。选取培养时间、温度和初始pH值进行中心组合设计及响应面优化实验,最优培养条件为:培养时间8天,培养温度24 ℃,初始pH值5.6,该培养条件下黄柄曲霉素的产量达到1.267 ±0.032 mg/L。3、通过中压正相柱层析对木豆内生真菌ELP-8-9乙酸乙酯层粗提物进行分离纯化,确定了木豆内生真菌发酵产物黄柄曲霉素的纯化工艺;内生真菌菌株ELP-8-9发酵粗提物通过中压正相柱层析进行分离纯化,确定了中压正相硅胶柱层析条件:300-400目硅胶;上样量与硅胶用量比为:1:10;洗脱剂为:正己烷:乙酸乙酯=20:1,10:1,7:1,5:1(v/v);梯度洗脱流速为10 mL/min。在柱层析过程中,TLC检测得到含有较高含量目标成分黄柄曲霉素的组份合并,减压浓缩至一定体积,有深黄色颗粒析出,即为目标化合物黄柄曲霉素粗品。木豆内生真菌ELP-8-9发酵提取物经过一次中压正相柱层析后进行结晶与重结晶,得到纯度为97.35%的黄柄曲霉素。4、对真菌源黄柄曲霉素抑制尖孢镰刀菌的活性进行初步研究,并通过温室盆栽试验考察了黄柄曲霉素对大豆根腐病的抑制活性;黄柄曲霉素对尖孢镰刀菌菌丝生长有抑制作用,同时还能够抑制其孢子萌发。当黄柄曲霉素浓度为80 μg/mL时,抑菌圈直径可达25.8 ± 0.5 mm,孢子萌发抑制率可达到91.5%,并且随着黄柄曲霉素浓度的增加,孢子萌发抑制率逐渐升高。利用黄柄曲霉素处理后的尖孢镰刀菌菌丝电导率增强,表明细胞膜通透性增加,导致细胞膜结构受损。对丙二醛含量的测定结果也说明细胞膜脂质过氧化程度高,细胞膜损坏程度大。从温室试验结果可以看出,当黄柄曲霉素浓度为80、100 μg/mL时15天的防效分别为81.25%、85.14%,与对照多菌灵10 μg/mL溶液的防效89.76%效果相当,表明了黄柄曲霉素具有在田间抑制大豆根腐病的应用潜力。本研究通过分离筛选获得了三株特异性产黄柄曲霉素的木豆内生真菌,并对其进行了系统的分类鉴定;同时,选取黄柄曲霉素含量最高的内生真菌ELP-8-9进行发酵培养基以及培养条件工艺优化,进一步确定了木豆内生真菌发酵产物黄柄曲霉素的纯化工艺;最后,对真菌源黄柄曲霉素抑制尖孢镰刀菌的活性进行了初步研究,并通过温室盆栽试验评估其对大豆根腐病的抑制效果。综上所述,本研究为木豆内生真菌及其活性成分黄柄曲霉素的有效利用奠定了坚实基础,也为微生物源农药的研发提供了新的路径和方法!