论文部分内容阅读
果胶杆菌属（Pactobbbacterium）细菌寄主范围广泛,在寄主植物上造成枯萎、腐烂及黑胫症状,是农业生产中十大植物病原细菌之一。果胶杆菌可以外泌一系列植物细胞壁降解酶类（PCWDEs）,这些酶类是其重要的致病因子。其中,胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（P.carotovorum subsp.carotovorum）的寄主范围最为广泛,可以侵染200多种植物,包括具有重要经济价值的蔬菜及花卉,例如马铃薯、白菜等。随着中国马铃薯主粮化的推进,对此类可造成马铃薯严重经济损失的植物病原细菌的致病机理研究具有非常重要的意义。Hfq作为一类全局调控蛋白,广泛存在于革兰氏阴性及阳性细菌中。在动物致病菌中大量研究表明,其参与调控了多个细胞过程及代谢途径,对大多数细菌的致病能力均有影响,但是有关Hfq蛋白在植物致病菌中的研究较少。为了探究Hfq在P.carotovorum subsp.carotovorum PccS 1中的致病相关功能,本研究通过同源重组的方法构建了 Hfq缺失突变体,致病性测定结果表明Δhfq的致病能力几乎完全丧失,生物学表型分析结果显示物缺失突变株的胞外酶分泌显著减少,与此同时hfq突变菌株的碳青霉烯抗生素活性、生物膜形成及游动能力均急剧下降。菌液注射寄主植物本氏烟（Nicotiana benthamiana）,突变体导致烟叶中胼胝质的积累增多。此外,hfq对Ⅵ型分泌系统行使正常功能具有重要作用,与菌株PccS1相比,hfq缺失突变体抑制了T6SS效应因子Hcp蛋白的分泌。RNA-seq分析表明,菌株PccS1中将近10%的基因受hfq调控,按基因功能分类,这些基因至少可以分成16类,包括脂质运输与代谢、碳水化合物的运输与代谢、能量产生与转化、无机离子运输与代谢等,且这些差异表达基因的转录表达水平与生物学表型分析结果一致。细菌中Hfq蛋白对于维持许多非编码小RNA（non-coding small RNAs,sRNAs）的稳定性具有不可或缺的作用。在细菌中,sRNAs可以调控靶标基因表达,参与许多生理过程。为 了探究 sRNAs 在 P.carotovorum subsp.carotovorum PccS 1 中的功能,Rfam软件预测结果表明,菌株PccS1具有27个sRNAs。通过同源重组的方法构建了 26个sRNAs的缺失突变体,并检测了突变体的致病能力,结果显示ArcZ,CsrB,SraG突变导致致病能力显著下降,其中ArcZ是依赖于Hfq的sRNA。生物学表型分析结果显示arcZ缺失突变株的几种胞外酶活性均有不同程度的降低,尤其是蛋白酶的活性下降极为显著,而果胶酶及纤维素酶活性均显著下降,与此同时AarcZ突变菌株碳青霉烯抗生素活性急剧减小,生物膜形成能力降低而游动能力增强。此外,arcZ缺失突变后Hcp蛋白的外泌被完全抑制,表明arcZ对于维持完整的T6SS功能具有重要意义。ArcZ是依赖于Hfq存在的sRNA,通过碱基互补配对与mRNA结合参与基因转录后调控。本研究表明菌株PccS1中ArcZ缺失突变导致致病能力显著降低。为了寻找ArcZ的靶标基因,我们通过Target RNA2预测得到57个靶标mRNA,并对其中部分基因进行了缺失突变。此外,本研究构建了受阿拉伯糖（ara）诱导表达的ArcZ菌株AarcZ（T1-PBAD-arcZ）及对照菌株AaarcZ（T1-PBAD）,用0.2%阿拉伯糖添加与无添加培养AarcZ（T1-PBAD-arcZ）和AaarcZ（T1-PBAD）,进行转录组测序分析,结果表明,阿拉伯糖诱导ArcZ表达后,23个基因上调表达,14个基因下调表达,通过基因敲除或基因过表达发现PccS14093,PccS10318及PccS12987过表达后致病能力显著下降,而PccS10230（rpoS）缺失突变后致病能力增强,其中rpoS在沙门氏菌（Salmonella enterica）中已被报道受ArcZ正调控,而其他3个抑制菌株PccS1致病能力的基因则是否是ArcZ的靶标基因需要进一步分析研究。本研究通过qRT-PCR检测进一步验证了转录组测序的结果。此外,本章根据已报道的rpoS与arcZ的结合位点对arcZ进行了 C70G的点突变,qRT-PCR的结果表明ArcZ在菌株PccS1中促进rpoS的表达。综上所述,Hfq 蛋白及 ArcZ RNA 在P.carotovorum subsp.carotovorum PccS1 的致病过程中参与调控了大量致病相关因子,为菌株PccS1侵染寄主植物所必需,具有重要的研究意义,本研究内容为进一步探究Hfq及ArcZ在软腐果胶杆菌中的致病机制建立了基础。