论文部分内容阅读
目的:构建和优化多功能紫杉醇-油酸和鸦胆子油分子配型组装纳米乳给药系统(PTX-OA/BJO CMNEs)的处方及制备工艺。从细胞水平和整体动物水平研究PTX-OA/BJO CMNEs的抗肿瘤机制与效应。方法:1.紫杉醇与油酸分析方法的建立采用高效液相色谱法检测PTX-OA,采用气相色谱法检测油酸(OA),并进行方法学验证,为后续试验的质量奠定基础。2.多功能鸦胆子油分子配型组装纳米乳给药系统的构建通过酯化反应制备PTX-OA,采用超声乳化法制备PTX-OA/BJO CMNEs。正交实验L16(43)以油酸质量浓度(A)即油相浓度、聚山梨酯-80用量(B)和超声功率(C)为考察因素,以平均粒径为评价标准,优选纳米乳的处方及制备工艺,并对优选的处方和工艺制备的纳米乳进行制剂学评价。3.多功能鸦胆子油分子配型组装纳米乳给药系统的体外评价采用 MTT 比色法测定 PTX-OA/BJO CMNEs、PTX-OA CMNEs、BJO CMNEs、Blank CMNEs对HepG-2细胞和Hela细胞的细胞毒作用。通过细胞周期和细胞凋亡实验,评价PTX-OA/BJO CMNEs与单独用药的差异性,探讨PTX-OA/BJO CMNEs的抗肿瘤作用机制。4.多功能纳米给药系统裸鼠肿瘤抑制实验裸鼠皮下注射HepG-2肝癌肿瘤细胞悬液造模,成瘤后通过肿瘤抑制率、组织切片HE染色、TUNEL、免疫组化等探讨PTX-OA/BJO CMNEs抗肿瘤作用及其机制。成果:1.建立了 PTX-OA与油酸的分析方法。PTX-OA在5~25 μg/mL浓度范围内线性关系良好,标准曲线Y=12.709X+6.2520(r=0.999 5)。油酸峰面积与苯甲酸苯酯峰面积比在3~27mg/mL浓度范围内成良好线性关系,Y=0.0312X-0.0172(r=0.999 8)。2.PTX-OA/BJO CMNEs最优处方为油相质量浓度为6.5mg/mL,聚山梨酯-80-油相质量比为3.5:6.5,超声乳化功率为120 W。制备的PTX-OA/BJO CMNEs外观良好,平均包封率为(100.6±1.9)%,平均粒径(108.7±2.3)nm,多分散系数(PDI)为0.232±0.038。TEM观察纳米乳粒径接近10nm,分布较均一。其体外释放度在48 h达到67%。纳米乳溶液置于4 ℃,避光环境下保存60 d,包封率、粒径基本保持不变,稳定性较好。3.MTT结果显示PTX-OA/BJO CMNEs在低浓度范围内(HepG-2在50~100 nmol/L的浓度范围内,Hela在5~25 nmol/L的浓度范围内)具有增强细胞毒性的作用。HepG-2细胞24h的试验结果显示,浓度为50nmol/L时,PTX-OA/BJOCMNEs组抑制率为(11.6±2.1)%,PTX-OACMNEs组为(2.4±1.0)%,两组抑制率存在显著差异(P<0.01)。48h的试验结果显示,在50~100nmol/L的浓度范围内,两组抑制率差异有统计学意义(P<0.01)。Hela细胞24h的试验结果表明,浓度为5nmol/L时,PTX-OA/BJO CMNEs 组抑制率为(12.0 ± 2.9)%,PTX-OACMNEs 组为(6.0±1.5)%,两组抑制率存在显著差异(P<0.01)。48h的试验结果显示,在5nmol/L~25 nmol/L的浓度范围内,两组抑制率差异有统计学意义(P<0.01)。HepG-2细胞周期结果显示,PTX-OA/BJO CMNEs组能使停滞在G2/M期的细胞百分比明显提高,PTX-OACMNEs 是(37.82± 1.32)%,PTX-OA/BJOCMNEs 组是(63.34±0.96)%,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。宫颈癌细胞Hela周期结果显示,PTX-OA/BJO CMNEs组细胞周期停滞在S期的细胞百分比组比其他组高,PTX-OA CMNEs 是(35.23±0.34)%,PTX-OA/BJOCMNEs 组是(40.48±0.58)%,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。HepG-2细胞凋亡结果显示,PTX-OA/BJO CMNEs组凋亡细胞为(34.45±1.34)%,BJO CMNEs 组是(9.80±4.10)%,PTX-OACMNEs 是(28.40±0.85)%,PTX-OA/BJO CMNEs与PTX-OA CMNEs差异具有统计学意义(P<0.05)。Hela细胞凋亡结果显示,PTX-OA/BJO CMNEs 组凋亡细胞为(30.50±2.55)%,BJO CMNEs 组是(11.10±0.77)%,PTX-OA CMNEs 是(19.80±1.27)%,PTX-OA/BJO CMNEs 与 PTX-OA CMNEs 差异有统计学意义(P<0.01)。4.鸦胆子油注射液、泰素组、PTX-OA/BJO CMNEs组的抑瘤率分别为24.7%,39.6%,45.4%,可见PTX-OA/BJO CMNEs组的抗肿瘤作用优于泰素组(P<0.05);也优于鸦胆子油注射液组(P<0.01)。在治疗过程中泰素组裸鼠体重和活跃度逐渐下降,说明泰素组存在的副作用较其他组大。HE染色后高倍镜(×100)下观察各组的心、肝、脾、肺、肾均未见明显细胞形态变化。PTX-OA/BJO CMNEs组癌细胞密度减少比PTX-OA CMNEs明显。TUNEL法检测细胞凋亡率顺序是:PTX-OA/BJO CMNEs>泰素>鸦胆子油注射液>生理盐水。免疫组化PCNA和拓扑异构酶Ⅱ(Topo Ⅱ)阳性结果呈棕黄色,其表达量依次是生理盐水>鸦胆子油注射液>泰素>PTX-OA/BJO CMNEs。上述结果表明,PTX-OA/BJO CMNEs联合用药有利于促进肿瘤细胞凋亡并抑制其DNA复制和增殖活性,且对正常组织器官无明显毒副作用。结论:本研究将PTX-OA与BJO联用制备成CMNEs,制备的PTX-OA/BJO CMNEs粒径接近100nm,粒径分布均一,包封率高,稳定性良好。体外细胞试验表明联合用药对细胞毒性,阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡的作用均优于单独用药。荷瘤裸鼠PTX-OA/BJO CMNEs抗肿瘤作用优于其他组,无明显组织毒副作用。体内外研究结果说明二者联用抗肿瘤活性更强。紫杉醇和鸦胆子油联合用药发挥抗肿瘤作用的机制包括诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞DNA复制,阻滞细胞周期和抑制增殖活性等多种途径。