纤维素酶(cellulase)能够催化水解纤维素,主要由外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.176,EC 3.2.1.91)、内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)和β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)组成。纤维素酶的用途广泛,其中在生物燃料领域的应用对解决全球化石能源短缺问题具有重要意义。本研究构建分泌融合表达型的纤维素酶工程菌。选取褐色高温单胞菌YX(Thermobifida fusca YX)的内切葡聚糖酶EG和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的β-葡萄糖苷酶BG,从GenBank获得目的氨基酸序列。根据大肠杆菌偏爱密码子设计其编码基因,并在上下游分别引入BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点,设计得到EG和BG的基因序列全长分别为1245 bp和1422 bp。PCR扩增目的基因序列经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,将目的基因重组至分泌融合表达载体pET-39b(+)和pET-39b(+)-sumo,成功构建3种分泌融合表达纤维素酶的工程菌,分别命名为大肠杆菌DS-EG,DS-BG和D-BG。经IPTG诱导,3种分泌融合表达纤维素酶的工程菌在大肠杆菌周质空间成功表达具有生物活性的目的蛋白。SDS-PAGE显示,DSEG、DS-BG和D-BG融合蛋白的分子量分别约为80 kDa、90 kDa和76 kDa。用CMC-Na作为内切葡聚糖酶的底物对其进行酶活测定,DS-EG的酶活为0.41 IU/mL,最适温度和最适pH分别为50℃和9.0。用pNPG作为β-葡萄糖苷酶的底物对其进行酶活测定,DS-BG的酶活为8.35 IU/mL,最适温度和最适pH分别为40℃和6.0;D-BG的酶活为3.29 IU/mL,最适温度和最适pH分别为40℃和7.0。比较两个重组β-葡萄糖苷酶的酶活发现,DS-BG的酶活高于D-BG。将DS-EG和酶活较高的DS-BG用于协同作用研究,发现两者有一定的协同作用,在50℃、pH 7.0时两个酶的协同作用最强。