论文部分内容阅读
研究背景及目的
卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，发病率次于子宫颈癌和子宫内膜癌，但死亡率居女性生殖系统恶性肿瘤首位，对女性生命健康造成严重威胁。卵巢恶性肿瘤中以上皮性卵巢癌最为多见。由于起病隐匿，70％卵巢癌患者就诊时已是晚期，手术和化疗综合治疗是目前中、晚期卵巢癌治疗的主要方法。肿瘤复发转移及化疗药物抵抗则是影响卵巢癌治疗效果的主要原因。因此，探究卵巢癌复发转移、化疗抵抗的分子机制，探寻有效的诊断治疗方法十分迫切。
晶体蛋白是哺乳动物晶状体细胞质中主要的结构蛋白，主要分为α、β、γ三大类，βB2晶体蛋白(βB2crystallin，Crybb2)是β族晶体蛋白中的主要组成成分。研究显示，Crybb2不仅在晶状体内作用，在晶状体外也是一种具有生理和病理特征的多功能蛋白。课题组研究发现βB2晶体蛋白与生殖能力密切相关，且可以作为影响小鼠卵巢、睾丸生殖功能的独立因素，βB2晶体蛋白通过引起颗粒细胞增殖、凋亡及激素分泌改变，使卵巢相应结构及功能受损，从而影响小鼠生殖。
近年来，Crybb2在肿瘤中的独特作用被逐渐认知，Crybb2在恶性肿瘤组织如乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、神经胶质母细胞瘤等肿瘤中亦存在表达，并在相应组织中均发挥重要作用。相关研究提示，Crybb2与肿瘤细胞生长分化、侵袭转移相关，并且Crybb2过度表达与恶性肿瘤不良预后密切相关。目前尚未有报道提示Crybb2在卵巢癌中的作用。为进一步深入研究Crybb2在卵巢癌中的作用，我们临床卵巢癌病人标本中发现Crybb2在肿瘤组织中同样存在表达。预实验研究发现，Crybb2表达水平上调后卵巢癌细胞迁移能力增加，并且在相同浓度化疗药物处理下，Crybb2过表达卵巢癌细胞其细胞凋亡率降低。因此，本研究将首先探索Crybb2对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗的影响。
卵巢癌细胞干性特征与化疗耐药、肿瘤转移及复发密不可分。进一步研究发现，过表达Crybb2可促进卵巢癌细胞EMT(上皮细胞－间充质细胞转换)能力，并且过表达Crybb2的卵巢癌细胞干性水平显著增强。上述结果提示，过表达Crybb2的卵巢癌细胞对化疗药物抵抗可能与介导卵巢癌细胞干性调控密切相关。相关研究提示，Crybb2作用与Wnt信号通路相关，Wnt信号通路是细胞存活的重要途径，与卵巢癌干细胞的耐药机制密切相关。那么Wnt信号通路是否在其中具有作用也值得深入研究。因此，我们将探索Crybb2对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗影响的具体作用机制。综上所述，我们将探究Crybb2对卵巢细胞侵袭转移及化疗抵抗的影响，并进一步探索Crybb2对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗影响的具体作用机制。
第一部分：Crybb2对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗的影响
我们选用HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞，采用慢病毒细胞转染技术构建过表达Crybb2卵巢癌细胞模型，Westernblot验证慢病毒转染效果后提示构建过表达Crybb2卵巢癌细胞模型成功，构建对照组及实验组：HO-8910、HO-LV-Ctrl、HO-LV-Crybb2；SKOV-3、SK-LV-Ctrl、SK-LV-Crybb2，分别为无病毒组、对照病毒组、实验病毒组。首先采用划痕实验处理HO-8910、HO-LV-Ctrl、HO-LV-Crybb2；SKOV-3、SK-LV-Ctrl、SK-LV-Crybb2组卵巢癌细胞，分别于0h、12h、24h记录细胞迁移改变，观察过表达Crybb2的卵巢癌细胞HO-LV-Crybb2、SK-LV-Crybb2组较Crybb2正常表达的卵巢癌细胞转移能力的改变；采用transwell实验观察48小时后，过表达Crybb2的卵巢癌细胞HO-8910、SKOV-3较Crybb2正常表达的卵巢癌细胞侵袭能力的改变。其次我们选用不同计量的化疗药物顺铂(Cisplatin)、紫杉醇(PTX; Paclitaxel)处理过表达Crybb2及正常表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞，采用cck-8实验观察过表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞在不同顺铂、紫杉醇药物浓度处理48小时后细胞增殖较正常表达Crybb2的卵巢癌细胞的变化；再次利用流式细胞学实验验证CCK8实验的结果，观察过表达Crybb2的卵巢癌细胞在顺铂、紫杉醇化疗药物处理48小时后细胞凋亡的改变。最后我们采用裸鼠构建裸鼠卵巢癌皮下成瘤模型，计量顺铂、紫杉醇化疗药物处理后裸鼠皮下成瘤大小的改变，体内实验观察过表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞与正常表达Crybb2的卵巢癌细胞在裸鼠皮下成瘤后对化疗药物治疗敏感性的差异。
结果提示，过表达Crybb2的HO-LV-Crybb2、SK-LV-Crybb2组卵巢癌细胞，其细胞侵袭转移能力较对照组HO-8910、HO-LV-Ctrl组及SKOV-3、SK-LV-Ctrl组卵巢癌细胞增强；并且，在顺铂、紫杉醇化疗药物处理后，过表达Crybb2的卵巢癌细胞HO-8910、SKOV-3较Crybb2正常表达的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞，其细胞存活率高、凋亡率低；同时，裸鼠皮下成瘤结果提示在相同条件顺铂、紫杉醇化疗药物处理后，过表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞成瘤体积较大，对化疗药物敏感性较低，而正常表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞成瘤体积较小，对化疗药物敏感性高。综上，结果提示过表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞侵袭转移能力更强，对化疗药物敏感性较低。
第二部分：Crybb2对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗影响的机制研究
卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗均与卵巢癌细胞的干性特征密切相关，卵巢癌细胞的EMT水平也是影响卵巢癌细胞侵袭转移的重要因素，本部分实验我们将初步探索Crybb2对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗影响的具体作用机制。首先我们利用细胞免疫荧光实验检测过表达Crybb2的卵巢癌细胞与Crybb2正常表达的卵巢癌细胞，其E-cadherin、vimentin的表达差异，观察过表达Crybb2的卵巢癌细胞较正常表达Crybb2的卵巢癌细胞EMT能力的改变。其次我们利用如下实验观察Crybb2对卵巢癌细胞干性水平的影响：细胞克隆实验观察在HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞中过表达Crybb2对细胞克隆形成能力的影响；qRT-PCR、Western-blot检测在HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞中过表达Crybb2对细胞干性标志物CD133、Nanog、Sox2表达的影响；裸鼠皮下成瘤实验观察在HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞中过表达Crybb2对裸鼠皮下成瘤能力的差异；将裸鼠皮下成瘤取材后利用免疫组织化学染色观察过表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞与正常表达Crybb2的卵巢癌细胞，其成瘤后细胞干性标志物的表达差异。结果提示，在HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞中过表达Crybb2后，其EMT表型明显增强、干性水平也有显著提高。
其次，我们利用Western-blot检测Wnt通路关键蛋白Cyclin-D1、c-Myc、Wnt3a在过表达Crybb2及正常表达Crybb2的卵巢癌细胞的表达水平。最后我们采用Wnt通路抑制剂Wnt-c59反向干预过表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞，再次通过CCK8实验观察Wnt通路抑制后过表达Crybb2的卵巢癌细胞在化疗药物顺铂、紫杉醇处理后细胞增殖、凋亡的改变，通过克隆形成实验观察Wnt通路抑制后过表达Crybb2的卵巢癌细胞干性特征的改变。结果显示，过表达Crybb2的卵巢癌细胞，其Wnt通路关键蛋白Cyclin-D1、c-Myc、Wnt3a表达升高；并且，过表达Crybb2的卵巢癌细胞经过Wnt通路抑制剂Wnt-c59反向干预处理后，其在化疗药物顺铂、紫杉醇处理后细胞存活率降低，敏感性升高，提示了Wnt通路在此过程中的重要作用。
综述所述，我们的研究可得出如下结论：Crybb2可提高卵巢癌细胞侵袭转移能力，促进EMT的发生；Crybb2可促进卵巢癌细胞化疗抵抗的发生；Crybb2可通过提高卵巢癌细胞干性水平促进卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗的发生；Crybb2可能通过介导Wnt信号通路提高卵巢癌细胞干性水平促进卵巢癌细胞化疗抵抗的发生。
卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，发病率次于子宫颈癌和子宫内膜癌，但死亡率居女性生殖系统恶性肿瘤首位，对女性生命健康造成严重威胁。卵巢恶性肿瘤中以上皮性卵巢癌最为多见。由于起病隐匿，70％卵巢癌患者就诊时已是晚期，手术和化疗综合治疗是目前中、晚期卵巢癌治疗的主要方法。肿瘤复发转移及化疗药物抵抗则是影响卵巢癌治疗效果的主要原因。因此，探究卵巢癌复发转移、化疗抵抗的分子机制，探寻有效的诊断治疗方法十分迫切。
晶体蛋白是哺乳动物晶状体细胞质中主要的结构蛋白，主要分为α、β、γ三大类，βB2晶体蛋白(βB2crystallin，Crybb2)是β族晶体蛋白中的主要组成成分。研究显示，Crybb2不仅在晶状体内作用，在晶状体外也是一种具有生理和病理特征的多功能蛋白。课题组研究发现βB2晶体蛋白与生殖能力密切相关，且可以作为影响小鼠卵巢、睾丸生殖功能的独立因素，βB2晶体蛋白通过引起颗粒细胞增殖、凋亡及激素分泌改变，使卵巢相应结构及功能受损，从而影响小鼠生殖。
近年来，Crybb2在肿瘤中的独特作用被逐渐认知，Crybb2在恶性肿瘤组织如乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、神经胶质母细胞瘤等肿瘤中亦存在表达，并在相应组织中均发挥重要作用。相关研究提示，Crybb2与肿瘤细胞生长分化、侵袭转移相关，并且Crybb2过度表达与恶性肿瘤不良预后密切相关。目前尚未有报道提示Crybb2在卵巢癌中的作用。为进一步深入研究Crybb2在卵巢癌中的作用，我们临床卵巢癌病人标本中发现Crybb2在肿瘤组织中同样存在表达。预实验研究发现，Crybb2表达水平上调后卵巢癌细胞迁移能力增加，并且在相同浓度化疗药物处理下，Crybb2过表达卵巢癌细胞其细胞凋亡率降低。因此，本研究将首先探索Crybb2对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗的影响。
卵巢癌细胞干性特征与化疗耐药、肿瘤转移及复发密不可分。进一步研究发现，过表达Crybb2可促进卵巢癌细胞EMT(上皮细胞－间充质细胞转换)能力，并且过表达Crybb2的卵巢癌细胞干性水平显著增强。上述结果提示，过表达Crybb2的卵巢癌细胞对化疗药物抵抗可能与介导卵巢癌细胞干性调控密切相关。相关研究提示，Crybb2作用与Wnt信号通路相关，Wnt信号通路是细胞存活的重要途径，与卵巢癌干细胞的耐药机制密切相关。那么Wnt信号通路是否在其中具有作用也值得深入研究。因此，我们将探索Crybb2对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗影响的具体作用机制。综上所述，我们将探究Crybb2对卵巢细胞侵袭转移及化疗抵抗的影响，并进一步探索Crybb2对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗影响的具体作用机制。
第一部分：Crybb2对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗的影响
我们选用HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞，采用慢病毒细胞转染技术构建过表达Crybb2卵巢癌细胞模型，Westernblot验证慢病毒转染效果后提示构建过表达Crybb2卵巢癌细胞模型成功，构建对照组及实验组：HO-8910、HO-LV-Ctrl、HO-LV-Crybb2；SKOV-3、SK-LV-Ctrl、SK-LV-Crybb2，分别为无病毒组、对照病毒组、实验病毒组。首先采用划痕实验处理HO-8910、HO-LV-Ctrl、HO-LV-Crybb2；SKOV-3、SK-LV-Ctrl、SK-LV-Crybb2组卵巢癌细胞，分别于0h、12h、24h记录细胞迁移改变，观察过表达Crybb2的卵巢癌细胞HO-LV-Crybb2、SK-LV-Crybb2组较Crybb2正常表达的卵巢癌细胞转移能力的改变；采用transwell实验观察48小时后，过表达Crybb2的卵巢癌细胞HO-8910、SKOV-3较Crybb2正常表达的卵巢癌细胞侵袭能力的改变。其次我们选用不同计量的化疗药物顺铂(Cisplatin)、紫杉醇(PTX; Paclitaxel)处理过表达Crybb2及正常表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞，采用cck-8实验观察过表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞在不同顺铂、紫杉醇药物浓度处理48小时后细胞增殖较正常表达Crybb2的卵巢癌细胞的变化；再次利用流式细胞学实验验证CCK8实验的结果，观察过表达Crybb2的卵巢癌细胞在顺铂、紫杉醇化疗药物处理48小时后细胞凋亡的改变。最后我们采用裸鼠构建裸鼠卵巢癌皮下成瘤模型，计量顺铂、紫杉醇化疗药物处理后裸鼠皮下成瘤大小的改变，体内实验观察过表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞与正常表达Crybb2的卵巢癌细胞在裸鼠皮下成瘤后对化疗药物治疗敏感性的差异。
结果提示，过表达Crybb2的HO-LV-Crybb2、SK-LV-Crybb2组卵巢癌细胞，其细胞侵袭转移能力较对照组HO-8910、HO-LV-Ctrl组及SKOV-3、SK-LV-Ctrl组卵巢癌细胞增强；并且，在顺铂、紫杉醇化疗药物处理后，过表达Crybb2的卵巢癌细胞HO-8910、SKOV-3较Crybb2正常表达的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞，其细胞存活率高、凋亡率低；同时，裸鼠皮下成瘤结果提示在相同条件顺铂、紫杉醇化疗药物处理后，过表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞成瘤体积较大，对化疗药物敏感性较低，而正常表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞成瘤体积较小，对化疗药物敏感性高。综上，结果提示过表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞侵袭转移能力更强，对化疗药物敏感性较低。
第二部分：Crybb2对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗影响的机制研究
卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗均与卵巢癌细胞的干性特征密切相关，卵巢癌细胞的EMT水平也是影响卵巢癌细胞侵袭转移的重要因素，本部分实验我们将初步探索Crybb2对卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗影响的具体作用机制。首先我们利用细胞免疫荧光实验检测过表达Crybb2的卵巢癌细胞与Crybb2正常表达的卵巢癌细胞，其E-cadherin、vimentin的表达差异，观察过表达Crybb2的卵巢癌细胞较正常表达Crybb2的卵巢癌细胞EMT能力的改变。其次我们利用如下实验观察Crybb2对卵巢癌细胞干性水平的影响：细胞克隆实验观察在HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞中过表达Crybb2对细胞克隆形成能力的影响；qRT-PCR、Western-blot检测在HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞中过表达Crybb2对细胞干性标志物CD133、Nanog、Sox2表达的影响；裸鼠皮下成瘤实验观察在HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞中过表达Crybb2对裸鼠皮下成瘤能力的差异；将裸鼠皮下成瘤取材后利用免疫组织化学染色观察过表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞与正常表达Crybb2的卵巢癌细胞，其成瘤后细胞干性标志物的表达差异。结果提示，在HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞中过表达Crybb2后，其EMT表型明显增强、干性水平也有显著提高。
其次，我们利用Western-blot检测Wnt通路关键蛋白Cyclin-D1、c-Myc、Wnt3a在过表达Crybb2及正常表达Crybb2的卵巢癌细胞的表达水平。最后我们采用Wnt通路抑制剂Wnt-c59反向干预过表达Crybb2的HO-8910、SKOV-3卵巢癌细胞，再次通过CCK8实验观察Wnt通路抑制后过表达Crybb2的卵巢癌细胞在化疗药物顺铂、紫杉醇处理后细胞增殖、凋亡的改变，通过克隆形成实验观察Wnt通路抑制后过表达Crybb2的卵巢癌细胞干性特征的改变。结果显示，过表达Crybb2的卵巢癌细胞，其Wnt通路关键蛋白Cyclin-D1、c-Myc、Wnt3a表达升高；并且，过表达Crybb2的卵巢癌细胞经过Wnt通路抑制剂Wnt-c59反向干预处理后，其在化疗药物顺铂、紫杉醇处理后细胞存活率降低，敏感性升高，提示了Wnt通路在此过程中的重要作用。
综述所述，我们的研究可得出如下结论：Crybb2可提高卵巢癌细胞侵袭转移能力，促进EMT的发生；Crybb2可促进卵巢癌细胞化疗抵抗的发生；Crybb2可通过提高卵巢癌细胞干性水平促进卵巢癌细胞侵袭转移及化疗抵抗的发生；Crybb2可能通过介导Wnt信号通路提高卵巢癌细胞干性水平促进卵巢癌细胞化疗抵抗的发生。