研究背景与目的在中国和许多国家,肺癌的死亡率是所有癌症中最高的,每年全世界大约有138万人死于肺癌。在我国,肺癌位居全国癌症发病首位。肺癌在组织学上分为四类:肺腺癌(LUAD)、肺鳞癌(LUSC)、大细胞肺癌和小细胞肺癌。肺腺癌是一种起源于腺体的上皮癌,是非小细胞肺癌(NSCLC)中最常见的病理亚型,即使从未吸烟的人也会患肺腺癌。由于肺腺癌是一种高异质性肿瘤,有多种分子、临床和病理学特征,因此其致癌驱动因子的发现提高了我们对肺腺癌生物学的理解。对肺腺癌分子变异的认识促进了针对这些变异的个体化疗法,并引领了“个性化”肿瘤医学的新时代。例如,带有表皮生长因子受体基因(EGFR)激活突变的肺腺癌患者使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的效果比无EGFR基因突变患者的效果好,间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因重排是TKI克里唑替尼对肺腺癌治疗效果的最佳预测因子。这些事实表明,治疗效果与特异性肿瘤基因组变异的存在有关。但是,有EGFR基因突变或ALK基因融合的患者只占肺腺癌患者的三分之一,说明了理解无EGFR基因突变或ALK基因融合肺腺癌的遗传基础的必要性。肺腺癌发生的潜在分子机制尚不清楚,而肺癌的异质性也让我们很难理解这种疾病。有EGFR或ALK变异的肺腺癌患者是否具有不同于没有这些变异的患者的独特遗传特征,还不得而知。而且,对肺癌,尤其是无EGFR基因突变或ALK基因融合肺腺癌中的重点基因的拷贝数和基因表达的相关性了解很少。另外,由于肺腺癌的发生和发展是由基因与基因之间的相互作用及调控失调引起的,因此明确调控通路中的治疗靶点有助于深刻理解肺腺癌的病因和发病机理。这些肺癌相关基因是否影响细胞功能,以及如何协调以影响细胞功能,尚未得到广泛研究。基于EGFR突变或ALK融合癌基因的靶向治疗已成为某些肺腺癌(LUAD)患者的标准治疗方法,但是,大多数LUAD患者并没有EGFR基因突变或ALK基因融合,而且其癌基因变异的特征仍有待明确。在本研究中,我们回顾性地分析了肺腺癌和肺鳞癌患者的基因组测序数据。我们对23个首席候选基因的肿瘤基因组变异进行评估,以探讨这两种肺癌类型之间的异同点。并进一步评估了十例显微切割的、无EGFR基因突变或ALK基因融合的肺腺癌中的这些候远基因的拷贝数。同时进一步探索了一些基因的拷贝数和基因表达之间的关联。本研究显示,在无EGFR基因突变或ALK基因融合的肺腺癌中,PTEN在基因组DNA和mRNA水平上的变化一致。这些结果提供了一个验证肺癌变相关分子的方法,并为肺腺癌治疗靶点的确定提供了依据。材料和方法标本是从2009年1月至2012年6月在佳木斯大学附属第一医院接受初次手术的十名肺腺癌患者身上采集的,包括来自同一名患者的肿瘤组织和远离肿瘤的正常组织。用手术切除的肺组织获取原发肺腺癌和远离肿瘤的正常肺组织标本,并保存为福尔马林固定的石蜡切片,用于生物标志物和病理分析。对从临床分子诊断实验室获取的肺癌标本进行EGFR基因突变和ALK基因融合检测。从福尔马林固定的石蜡组织切片中提取基因组DNA和总RNA。采用实时荧光PCR技术、用人EGFR基因突变检测试剂盒分析EGFR基因突变。采用多路一步法RT-PCR技术、用人ALK基因融合检测试剂盒检测ALK基因融合变异。在7500实时PCR系统上完成RT-PCR,并通过对PCR和RT-PCR产物进行直接测序确认EGFR基因突变和ALK基因融合不存在。分析基因拷贝数和基因表达,用ArcturusPixCell II系统(Thermo Fisher Scientific)和奥林巴斯IX-50显微镜从靶组织切片中激光捕获显微切割细胞(5 × 103),用 PicoPure RNA 提取试剂盒(Thermo Fisher Scientific)提取RNA,并用RT-PCR法扩增。用PicoPure DNA分离试剂盒(Thermo Fisher Scientific)从显微切割组织中提取基因组DNA。用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific)测量浓度。拷贝数的定量分析是用(QIAGEN qBiomarker拷贝数PCR检测法在7500实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)上完成。每个标本的相对基因拷贝数计算为:2 × T拷贝数(肿瘤拷贝数/MRef拷贝数)/N拷贝数(同一患者的远离肿瘤的正常组织的拷贝数/MRef拷贝数)。基因表达的定量 PCR(qPCR)用 Power SYBR Green Master Mixture(Thermo Fisher Scientific)由7500实时PCR系统来完成。逆转录用随机六聚体引物和SuperScriptⅡ逆转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific)来完成。倍数变化是用△ △Ct法来计算。相对基因表达检测的内源参照基因为GAPDH。我们对公共数据集进行综合分析,以评估23个肺癌相关基因的基因组学变异。本研究使用的所有数据集均来自公开的数据来源,包括Broad(哈佛-麻省理工学院Broad研究所)和MSKCC(纪念斯隆凯特林癌症中心),或来自各种计划,包括TCGA(癌症基因组图谱计划-癌症基因组)和TSP(肿瘤测序计划)。肺腺癌和肺鳞癌患者肿瘤组织的全基因组外显子组或靶向测序数据及人口统计信息提取自以前的研究(所有测序数据均已在线存储)。用c-Bioportal完成23个肺癌相关基因(用QIAGEN在人肺癌拷贝数PCR芯片中挑选出来的)的跨癌症变异的整合。用cBioPortal癌症基因组网站(网址http://www.cbioportal.org)完成数据挖掘,以测定与这些基因的变异有关的情况的发生率。肿瘤组织和远离肿瘤的正常对照组织之间的基因拷贝数差异用非参数曼-惠特尼U检验来分析。肿瘤组织和远离肿瘤的正常对照组织之间的基因表达差异用配对双样本t检验来分析。DNA拷贝数和基因表达水平之间的关联用皮尔逊相关性检验来评估。用标准错误发现率(FDR)和Bonferroni校正法分析肿瘤基因组变异。P<0.05时有统计学显著性,所有统计检验均为双侧检验。用SPSS 24,R软件包和GraphPad Prism 6.0完成分析。结果1.肺癌相关基因的体细胞变异分析CCND1、CSMD1、EGFR、EMSY、MYC、PDGFRA、PIK3CA、PTPRD、RB1、REL和ZNF217,表现出多种变异(同时发生扩增、缺失和突变)。在肺鳞癌中只有MYC基因有多种变异,而在肺腺癌中CCND1、EMSY、PIK3CA和ZNF217基因均有多种变异。肺腺癌中CCND1、PIK3CA、FGFR1、REL和ZNF217基因扩增的频率高于肺鳞癌,肺鳞癌的EMSY、PDGFRA和REL基因突变频率高于肺腺癌。2.无EGFR基因突变或ALK基因融合肺腺癌患者的临床病理学特征这些患者包括5名男性和5名女性,平均年龄55岁(范围:46～72岁)。其中6名患者从未吸过烟,4名患者吸烟。这些患者的肿瘤均为EGFR基因突变和ALK基因融合阴性。病理分期为“肿瘤Ⅱ期”(n=7)和“肿瘤Ⅲ期”(n=3),以“中等分化”级别为主(n=5)。6名患者的肿瘤侵犯局部淋巴结。3.肺腺癌患者的肿瘤和对应正常肺组织的基因拷贝数的对比定量与正常肺组织相比,23种基因中大多数的拷贝数变异没有显著变化。三种抑癌基因(PTEN、RB1和PTPRD)和一种致癌基因(HMGA2)在肺腺癌组织中的拷贝数较低(P<0.05)。4.肺腺癌患者肿瘤组织中低拷贝数基因的拷贝数与mRNA水平之间的关联肿瘤组织与正常组织中的mRNA水平比较结果显示,抑癌基因PTEN和RB1的表达水平明显较低(P<0.05)。抑癌基因PTPRD和致癌基因HMGA2,肺腺癌肿瘤组织与正常组织中的基因表达没有显著差异(PTPRD:n=6,P=0.506;HMGA2:n=8,P=0.462)。虽然肿瘤组织中的 PTEN 和 RB1mRNA水平都有所降低,但只有PTEN基因的拷贝数与表达相关(R2=0.827,P=0.003)。5.无EGFR基因突变或ALK基因融合肺腺癌中基于拷贝数的肺癌相关基因相互关系EMSY 与 CCND1、EMSY 与 PIK3CA、CCND1 与 CDKN2A 以及 CCND1与PIK3CA之间的相关性较强(均为P<0.001)。EMSY与CCND1、EMSY与PIK3CA以及CCND1与PIK3CA之间呈正相关(矩阵值均>0.9)。CDKN2A基因起肿瘤抑制作用,与CCND1呈负相关(矩阵值=-0.927,P<0.001)。结论我们对公共数据集进行分析,以评估23种肺癌相关基因的基因组变异,并查找肺腺癌和肺鳞癌的病因和发病机理。我们还评估了无EGFR基因突变或ALK基因融合肺腺癌患者的手术切除肿瘤和远离肿瘤的正常肺组织的肿瘤基因组学特征,并评估了这些候选基因之间可能存在的关系。我们的研究结果对无EGFR基因突变或ALK基因融合肺腺癌的分子分层和治疗靶点有重要意义。这些信息也推动了我们对与肿瘤基因组拷贝数变异和基因表达有关的肺癌发生的理解,有助于确定肺腺癌患者的个性化治疗策略。在为无EGFR基因突变或ALK基因融合的肺腺癌患者制定治疗策略时应优先考虑PTEN-PIK3CA 和 RB1-CCND1 通路。