目的：　　 本课题组的前期实验证明了丹参水提物能有效地防治糖皮质激素引起的大鼠骨丢失;体外实验观察到丹参水提物对糖皮质激素诱导的骨髓基质干细胞的成脂分化能力有抑制作用,并能提高骨髓基质干细胞表达碱性磷酸酶的活性,刺激骨钙素的分泌。但对其作用机制不明确。Wnt/β-catenin通路影响骨髓基质干细胞的增殖、迁移,并调控其分化方向。活化Wnt/β-catenin途径能促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化,抑制脂肪细胞的分化与成熟。因此,本研究通过观察丹参水提物的主要有效成份丹参素与丹酚酸B对体外大鼠骨髓基质干细胞(Marrowstromal stem cells,MSCs)成脂分化与成骨分化能力的影响,以探讨丹参素与丹酚酸B对骨髓基质干细胞的分化方向的调节作用;通过观察丹参素与丹酚酸B对骨髓基质干细胞成骨分化过程中的关键基因Runx2,成脂分化过程的关键基因过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ),以及调控骨髓基质干细胞的分化方向的Wnt/β-catenin信号通路中的Dickkopf-1,β-catenin基因的影响,以探讨丹参水提物丹参素与丹酚酸B对骨髓基质干细胞分化方向调控的作用机制。为中药丹参作为抗骨质疏松的新作用提供科学依据。　　 方法：　　 1大鼠骨髓基质干细胞体外培养及成骨与成脂分化的鉴定　　 通过传代贴壁筛选的方法分离纯化骨髓基质干细胞。应用油红染色法判断是否成功诱导骨髓基质干细胞向脂肪细胞方向分化。应用碱性磷酸酶染色法与茜素红染色法判断否成功诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞方向分化,并以此鉴定分离纯化的骨髓基质细胞中是否含有干细胞成分。　　 2丹参素与丹酚酸B对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞与脂肪细胞分化方向的影响　　 观察不同浓度的丹参素与丹酚酸B对骨髓基质干细胞成脂分化率及过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)mRNA的影响,判断药物对骨髓基质干细胞成脂分化能力的影响。检测碱性磷酸酶的活性以及Runx2mRNA的表达以判断药物对骨髓基质干细胞成骨分化能力的影响。并观察丹参素与丹酚酸B作用的量效关系和找出它们在实验中的最佳作用浓度。　　 3大鼠骨髓基质干细胞体外培养在成骨与成脂分化诱导下的Wnt/β-catenin信号通路的调节　　 通过传代贴壁筛选的方法分离纯化骨髓基质干细胞,分别进行成脂诱导与成骨诱导。应用Wnt信号通路PCR芯片检测骨髓基质干细胞在成脂分化与成骨分化诱导后Wnt信号途径相关基因表达,以分析和寻找与骨髓基质干细胞定向分化相关的靶基因。　　 4丹参素与丹酚酸B对调控大鼠骨髓基质干细胞分化的Wnt/β-catenin信号通路关键基因Dickkopf-1与p-catenin的影响　　 选用纯化的大鼠骨髓基质干细胞,把细胞分成:阴性对照组、成脂诱导组、成骨诱导组、成脂诱导+丹参素组、成脂诱导+丹酚酸B组,丹参素组,丹酚酸B组,药物作用后检测细胞Dickkopf-1mRNA与β-catenin mRNA的表达。探讨丹参素与丹酚酸B是否通过调节Wnt/β-catenin信号通路影响大鼠骨髓基质干细胞分化方向。　　 结果：　　 1大鼠骨髓基质干细胞体外培养及成骨与成脂分化的鉴定　　 通过传代贴壁筛选的方法分离纯化得到较为均一成纤维细胞型的骨髓基质细胞。成骨诱导7后天碱性磷酸酶染色呈阳性,55天后骨结节茜素红染色呈阳性;成脂诱导后出现个体增大的脂肪细胞,其脂滴可被油红O染为红色。说明分离的细胞具有干细胞特性,并能被定向诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,可用于检测药物的作用。　　 2丹参素与丹酚酸B对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞与脂肪细胞分化的影响:　　 骨髓基质干细胞用成骨诱导剂干预后碱性磷酸酶的表达较未诱导组明显增加(p＜0.01)。成骨分化的关键基因Runx2mRNA表达也较未诱导组明显增多。丹参素各个浓度在3天时无促进细胞表达碱性磷酸酶的作用。浓度为5×10-6mol/L,5×10-7mol/L的丹参素与正常对照组相比,在第5天,7天能升高ALP的活性(P＜0.05)。丹酚酸B浓度为10-6mol/L与10-7mol/L时有促进骨髓基质干细胞分泌碱性磷酸酶的作用,该作用在药物作用第三天时出现,第5天和第7天时最明显(P＜0.05)。浓度为5×10-7mol/L丹参素与浓度为10-7mol/L丹酚酸B与正常对照组组相比,均能增加Runx2mRNA的表达,以丹参素作用明显。添加脂肪诱导剂后rMSCs分化为脂肪细胞的能力比正常对照组明显加强。油红染色化学比色值(p＜0.01)及PPARγmRNA的表达较正常对照组明显增加。成脂诱导加药组的成脂分化率比脂肪诱导组减少但差别无统计学意义(P＞0.05),但随着时间的延长比色值并未明显增加。浓度为5×10-7mol/L丹参素与浓度为10-7mol/L丹酚酸B均能减少PPARγmRNA的表达,以丹参素作用明显。　　 3大鼠骨髓基质干细胞体外培养在成骨与成脂分化诱导下的Wnt/β-catenin信号通路的调节　　 通过传代贴壁筛选的方法分离纯化得到较为均一骨髓基质干细胞。经诱导后可向成骨细胞和脂肪细胞方向分化。在Wnt信号通路89个相关基因中,与未诱导组相比,骨髓基质干细胞成脂诱导后Wnt信号通路表达上调的基因(Dkk-1、kremen、Fzd1)等15个(ratio＞2),下调的基因(sFrp5,β-catenin,Dvl3,Tct7)等16个(ratio＜0.5)。成骨诱导后Wnt信号通路表达上调的基因(Dkk1,kremen,β-catenin,Wnt11)6个(ratio＞2),表达下调的基因(sFrp5,sFRP4,Fzdl)等15个(ratio＜0.5)。　　 4丹参素与丹酚酸B对调控大鼠骨髓基质干细胞分化的Wnt/β-catenin信号通路关键基因Dickkopf-1mRNA与β-cateninmRNA的影响。　　 对照组、诱导组、和给药组的大鼠骨髓基质干细胞均能表达Dickkopf-1与β-catenin mRNA。其中脂肪诱导组Dickkopf-1表达较对照组明显增高,β-catenin则较对照组明显下降。成骨诱导组则相反:Dickkopf-1较对照组表达明显降低,β-catenin则较对照组明显增多。脂肪诱导+丹参素组、脂肪诱导+丹酚酸B组的Dickkopf-1表达均比脂肪诱导组明显减少,而β-catenin则比脂肪诱导组明显增多。丹参素组、丹酚酸B组表达的Dickkopf-1比正常组少,同时丹参素组β-catenin的表达比正常组多,但丹酚酸B组β-catenin的表达比正常组少。　　 结论：　　 1丹参素与丹酚酸B均可促进大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化,增加MSCs的碱性磷酸酶活性,增加成骨分化关键基因Runx2mRNA的表达。丹参素和丹酚酸B同时使脂肪分化的关键基因PPARγmRNA表达减少,能使脂肪细胞脂滴减少。但不能减少脂肪细胞的数目。　　 2大鼠骨髓基质干细胞在成骨分化与成脂分化过程中主要影响Wnt/β-catenin信号通路中的Dickkopf-1基因。　　 3丹参素通过减少Wnt/β-catenin信号通路中的Dickkopf-1mRNA的表达,增加β-catenin mRNA的表达,调节大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化,减少其向脂肪细胞分化。丹酚酸B则主要通过影响Dickkopf-1的表达促进骨髓基质干细胞成骨分化而对骨髓基质干细胞成脂分化无影响。提示丹参素和丹酚酸B可通过影响Wnt/β-catenin信号通路的机制发挥抗骨质疏松的作用。