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牛结核病的诊断方法主要包括作为“金标准”但灵敏度低且需时较长的病原菌的分离鉴定，OIE推荐的、基于结核病阳性牛特异性T细胞免疫反应水平且具有较高灵敏度的结核菌素皮内变态反应试验和IFN-反释放试验以及缺少足够灵敏度和特异性、仅作为辅助性诊断手段的血清学检测方法。鉴于牛结核菌素（PPD-B）生产过程需要牛分枝杆菌强毒株，存在散毒危险，与禽结核菌素（PPD-A）、环境分枝杆菌、BCG存在共同抗原，存在部分假结核阳性牛的结果，因其是多种蛋白、脂类和糖的混合物，定性定量困难，难以保持批次间的稳定性，而重组牛分枝杆菌特异性蛋白具有成份明确、易于质控、制备简单且无生物安全隐患，在评价其应用潜力的基础上，有望替代PPD-B建立重组蛋白介导的、具有更高敏感性和特异性的结核菌素皮内变态反应试验和IFN-皮释放试验等新型牛结核病检测方法。本研究在构建、表达、纯化了纯度大于90%、内毒素含量低于2EU/mg、经IFN-/释放试验和间接ELISA试验评价具有良好的T细胞和B细胞活性、有望作为牛结核病诊断抗原的CFP10、ESAT6、CE、TB10.4、TB27.4、Rv3872、MX、MPT63、MPT64、MPB70、MPB83和Ag85B等12种重组牛分枝杆菌特异性蛋白的基础上，研究建立了可有效区分结核病阳性牛和禽分枝杆菌感染牛以及BCG免疫牛、基于重组蛋白组合物CFP10/ESAT6/TB10.4和CFP10/ESAT6/MPT63/Rv3872皮内变态反应检测方法，对来自8个牛场共计1097头牛进行的双盲试验结果显示：其特异性为97%，敏感性为92%，与传统检测方法之间具有良好的符合率，其κ值均大于0.75；同时，在前期研究的基础上，重点对重组蛋白CE作为IFN-白释放试验刺激原的反应条件进行了优化，并通过临床试验评价其检测效果，结果表明：其与PPD-B皮内变态反应之间的spearman r=0.6893，与IFN-r释放试验之间的spearman r=0.9229，重组蛋白CE作为刺激原建立的IFN-原释放试验检测方法的特异性可达98%以上，敏感性为69-77%，有望作为自主研发的IFN-为释放试验检测试剂盒配套刺激原的潜力。在开展上述研究的同时，为了评价牛结核病发展过程中不同诊断方法的检测效果，定期以皮内变态反应试验、IFN-述释放试验和间接ELISA对牛分枝杆菌、禽分枝杆菌和BCG感染牛进行检测，结果表明：PPD-B为刺激原的皮内变态反应试验和IFN-的干扰素释放试验在牛分枝杆菌感染后96h即可检测出阳性牛，并持续至感染后58w，但是无法区分BCG免疫牛和牛分枝杆菌感染牛，且禽分枝杆菌感染组也会对PPD-B有一定的反应；牛分枝杆菌感染牛在感染后2-58w仅产生针对MPB70和MPB83的IgG抗体，且不同个体的抗体水平及抗体变化趋势不一致；基于重组蛋白组合物CFP10/ESAT6/TB10.4和CFP10/ESAT6/MPT63/Rv3872的皮内变态反应检测方法和以重组蛋白CE为刺激原的IFN-的释放试验可有效诊断牛分枝杆菌感染牛，且可以区分牛分枝杆菌感染牛和禽分支杆菌感染牛及BCG免疫牛，有望成为一种新型的牛结核病诊断方法。