研究背景与目的食管癌(Esophageal cancer)作为全球常见的恶性肿瘤之一,具有高发病率、高死亡率的特点。由于食管癌早期临床症状不典型,临床发现较晚,预后较差,五年存活率低,成为目前主要公共卫生学问题之一。外泌体miRNA是近年来新发现的参与细胞间通讯的小分子,在肿瘤微环境中发挥着重要的作用,影响肿瘤细胞的发生发展。由于其特异性高表达的特点,提示肿瘤外泌体miRNA可作为早期诊断和预后的生物标志物,为临床上较早发现癌症转移提供重要价值。因此,本研究探究了食管癌外泌体miRNA对食管癌微环境中巨噬细胞极化状态的影响,导致微环境改变引起食管癌转移的作用和机制,为食管癌外泌体miRNA作为肿瘤早期诊断生物标志物提供了研究基础与数据支持。研究方法1.收集淮安地区经病理或胃镜确诊的食管癌病例36例,按照年龄与性别1:1配对的原则,选择无消化系统病史的健康对照36例,收集食管癌病例与健康对照人群血液样品,应用外泌体分离试剂盒提取血浆外泌体,并应用anti-EpCAM进行肿瘤外泌体的分离纯化,提取外泌体小RNA,采用qRT-PCR进行miR-21-5p的表达水平检测。2.应用人白血病单核细胞系THP-1,通过佛波酯PMA诱导成为单核巨噬细胞即M0型巨噬细胞,之后经脂多糖LPS,人重组IL-4分别诱导,建立M1型和M2型巨噬细胞模型,应用ELISA和qRT-PCR检测其标志物表达水平。3.采用差速离心结合超速离心的方法,收集食管癌细胞分泌外泌体,应用Western blot检测外泌体标志蛋白CD63,TSG101与非特异性蛋白GM-130的表达水平进行外泌体的鉴定。4.构建细胞体外共培养模型,将Cy3-miR-21-5p转染食管癌细胞EC109,通过与M0型巨噬细胞共培养24h后,观察外泌体miR-21-5p在细胞间的传递特征,并应用qRT-PCR检测miR-21-5p在受体中的传递效率。收集Cy3-miR-21-5p mimic转染食管癌细胞分泌的外泌体,加入M0型巨噬细胞培养液中,应用共聚焦显微成像技术,观察M0型巨噬细胞对外泌体来源miR-21-5p的摄取。5.在建立的共培养模型中,观察受体细胞(M0型巨噬细胞)的生物学功能变化。应用qRT-PCR和ELISA法检测外泌体miR-21-5p对受体细胞的极化作用,应用流式细胞术检测受体细胞的吞噬功能与周期分布,应用EdU染色法检测受体细胞的增殖功能。6.收集巨噬细胞上清液,作为食管癌细胞EC109的培养液,应用Transwell小室检测对食管癌细胞迁移和侵袭的影响。7.应用qRT-PCR、Western Blot和双荧光素酶报告基因实验(DLR)验证外泌体miR-21-5p的靶基因。应用PI3K/AKT抑制剂(LY294002)处理巨噬细胞后,Western blot检测PTEN/AKT/STAT6通路中相关蛋白表达水平。应用TGF-βRI/II抑制剂(LY2109761)处理经巨噬细胞上清培养的食管癌细胞,Western blot检测p-Smad2及EMT相关蛋白表达水平。研究结果一、外泌体miR-21-5p在食管癌中的表达特征1.食管癌细胞及外泌体中miRNA的表达分析Western blot方法鉴定食管癌细胞外泌体,发现其高表达外泌体特异性蛋白CD63,TSG101,而非特异性蛋白GM-130呈阴性表达。同时,应用qRT-PCR对食管癌细胞及外泌体中候选miRNA的检测发现,miR-21-5p在EC109细胞及其外泌体中表达水平均最高。2.食管癌患者与健康对照人群血浆中外泌体miR-21-5p的差异分析食管癌病例血浆样品肿瘤分泌外泌体中,miR-21-5p的表达水平显著高于健康人群血浆外泌体中表达水平,miR-21-5p表达水平是健康人群的7.62倍,差异具有统计学意义(P<0.05),证实食管癌患者血浆外泌体中miR-21-5p特异性高表达。二、外泌体miR-21-5p促进巨噬细胞M2型极化1.外泌体miR-21-5p在细胞间的传递特征共聚焦显微镜拍摄结果,在M0型巨噬细胞胞浆中可见红色荧光,即为Cy3标记的miR-21-5p,提示,miR-21-5p可由外泌体作为传递介质,被巨噬细胞摄取。2.巨噬细胞极化模型的建立在建立的M1型巨噬细胞中,M1型巨噬细胞标志物IL-6,TNF-α,IL-1β等表达水平显著升高;在建立的M2型巨噬细胞中,M2型巨噬细胞标志物TGF-β,IL-10,CD206,CD209等表达水平显著升高。结果证实,成功建立M1型和M2型巨噬细胞模型。3.外泌体miR-21-5p促进巨噬细胞M2型极化设置四个实验组:EC109细胞转染miR-NC mimics与巨噬细胞共培养组(Exo-miRNC组),EC109细胞转染miR-21-5p mimics与巨噬细胞共培养组(Exo-miR-21-5p组),M2型巨噬细胞组(M2 macrophage组),M2型巨噬细胞加miR-21-5p inhibitor组(M2+miR-21-5p inhibitor组),建立Transwell小室共培养模型,共培养24h后,发现外泌体miR-21-5p可促进M0型巨噬细胞向M2型极化。(1)应用qRT-PCR检测四个实验组中巨噬细胞的M1型和M2型标志物的mRNA表达水平。相对于Exo-miR-NC组,Exo-miR-21-5p组M2型巨噬细胞标志物TGF-β,IL-10,CD206,CD209 mRNA表达水平显著升高(P<0.05),对M1型巨噬细胞标志物TNF-α,IL-6,IL-1βmRNA表达水平显著抑制(P<0.05)。M2+miR-21-5p inhibitor组相比于M2macrophage组,M2型巨噬细胞标志物TGF-β,IL-10,CD206,CD209,CCL13 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。(2)应用ELISA检测四个实验组中巨噬细胞的M1型和M2型标志物的蛋白表达水平。相对于Exo-miR-NC组,Exo-miR-21-5p组显著抑制IL-6的蛋白表达水平,降低了28.75%(P<0.05),但对TNF-α的表达水平无影响(P>0.05),M2型巨噬细胞标志物IL-10,TGF-β的蛋白表达水平显著升高。M2+miR-21-5p inhibitor组相比于M2 macrophage组,M2型巨噬细胞标志物IL-10,TGF-β的表达水平显著降低(P<0.05),M1型巨噬细胞标志物TNF-α显著升高(P<0.05),对IL-6表达水平无影响(P>0.05)。4.外泌体miR-21-5p对巨噬细胞生物学功能的影响外泌体miR-21-5p可抑制巨噬细胞的吞噬功能,促进巨噬细胞增殖,对巨噬细胞的周期分布没有影响。(1)应用流式细胞术检测巨噬细胞的吞噬功能。发现Exo-miR-NC组细胞吞噬率为(75.33±2.13)%,Exo-miR-21-5p组细胞吞噬率为(64.43±7.34)%,应用两组t检验进行统计学分析,发现Exo-miR-21-5p组细胞吞噬率显著低于Exo-miR-NC组,具有统计学意义(P<0.05)。(2)应用EdU染色法检测巨噬细胞的增殖率。发现Exo-miR-NC组细胞增殖率为(27.86±0.06)%,Exo-miR-21-5p组细胞增殖率为(32.32±0.06)%,应用两组t检验进行统计学分析,发现两组差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)应用流式细胞仪检测巨噬细胞周期分布。发现Exo-miR-NC组周期分布为G1期(49.79±1.17)%,S期(25.57±1.49)%,G2期(24.64±0.97)%,Exo-miR-21-5p组周期分布为G1期(48.66±3.74)%,S期(25.74±1.44)%,G2期(25.60±3.64)%,应用卡方检验进行统计学分析,发现两组周期分布差异无统计学意义(P>0.05)。三、外泌体miR-21-5p促巨噬细胞极化对食管癌细胞转移的影响针对上述四个实验组,收集巨噬细胞上清液,作为食管癌细胞EC109的培养液,分别应用Transwell小室检测对食管癌细胞迁移、侵袭的影响。(1)应用Transwell小室检测食管癌细胞的迁移能力。发现Exo-miR-NC组穿膜细胞数为29.20±3.29,Exo-miR-21-5p组穿膜细胞数为41.73±7.30,与Exo-miR-NC组相比增加了42.91%(P<0.01)。M2 macrophage组穿膜细胞数为46.60±4.56,M2+miR-21-5p inhibitor组穿膜细胞数目为19.80±3.77,与M2 macrophage组相比降低了57.51%(P<0.01),说明发生M2型极化的巨噬细胞可促进食管癌细胞的迁移能力,而抑制M2型巨噬细胞中miR-21-5p的表达,则与之相反。(2)应用Transwell小室检测食管癌细胞的侵袭能力。发现Exo-miR-NC组穿膜细胞数为18.93±3.51,Exo-miR-21-5p组穿膜细胞数为24.47±6.33,相比于Exo-miR-NC组增加了29.27%(P<0.01),M2 macrophage组穿膜细胞数为41.60±4.72,M2+miR-21-5p inhibitor组穿膜细胞数目为16.80±4.60,与M2 macrophage组相比降低了59.62%(P<0.01),说明发生M2型极化的巨噬细胞可促进食管癌细胞的侵袭能力,而抑制M2型巨噬细胞中miR-21-5p的表达,则与之相反。(3)应用Western blot检测EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Snail和α-SMA的表达水平。发现Exo-miR-21-5p组相比于Exo-miR-NC组,N-cadherin、Snail和α-SMA蛋白表达水平显著增加,E-cadherin蛋白表达水平显著降低。M2+miR-21-5p inhibitor组相比于M2 macrophage组,N-cadherin、Snail和α-SMA蛋白表达水平显著降低,E-cadherin蛋白表达水平显著升高。说明发生M2型极化的巨噬细胞可促进食管癌细胞的EMT过程,而抑制M2型巨噬细胞中miR-21-5p的表达,则与之相反。四、外泌体miR-21-5p促巨噬细胞极化对食管癌细胞转移的机制研究(1)应用qRT-PCR、Western blot和双荧光素酶报告基因实验验证外泌体miR-21-5p的靶基因PTEN。qRT-PCR结果显示,Exo-miR-21-5p组PTEN mRNA表达水平明显低于Exo-miR-NC组,降低了35.6%,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测结果显示,Exo-miR-21-5p组PTEN蛋白水平明显下调了59.5%。通过双荧光素酶报告基因实验发现,miR-21-5p+PTEN(WT)实验组荧光值显著低于miR-21-5p+PTEN(Mut)实验组,是miR-21-5p+PTEN(Mut)实验组荧光值的0.64倍(P<0.05)。证实,miR-21-5p可与PTEN 3’UTR区特异性结合,降低PTEN基因mRNA与蛋白水平的表达。(2)为研究食管癌细胞外泌体miR-21-5p促巨噬细胞M2型极化的机制,应用Western blot检测M0型巨噬细胞中PTEN/AKT/STAT6通路各蛋白表达水平。结果显示,ExomiR-21-5p组相比与Exo-miR-NC组,PTEN蛋白表达降低,激活PI3K/AKT通路,使Akt,STAT6磷酸化水平升高。加入PI3K/AKT抑制剂(LY294002)(50μM)后,PTEN蛋白水平恢复了38.23%,p-Akt和p-STAT6表达水平降低了60.16%,48.32%,提示阻断PI3K/Akt信号通路后,可降低Exo-miR-21-5p组p-Akt、p-STAT6的表达。(3)为研究发生M2型极化的巨噬细胞对食管癌转移的影响机制,我们收集上述四组处理组细胞上清液,作用于食管癌细胞EC109,收集细胞蛋白进行p-Smad2及EMT相关蛋白表达水平。相比于Exo-miR-NC组,Exo-miR-21-5p组Smad2蛋白磷酸化水平显著升高,N-cadherin,α-SMA,Snail蛋白水平显著升高,E-cadherin蛋白水平显著降低。加入TGF-βRI/II抑制剂(LY2109761)后,Exo-miR-21-5p组(20μM),Smad2蛋白磷酸化水平降低了80.16%,N-cadherin,α-SMA,Snail蛋白表达水平分别抑制了52.98%,69.62%,77.93%,而E-cadherin蛋白表达水平恢复了82.39%。研究结论1.外泌体miR-21-5p在食管癌血浆中特异性高表达,可能与食管癌的发生发展有关。2.外泌体miR-21-5p可被巨噬细胞(受体细胞)摄取,促进巨噬细胞M2型极化。此外,外泌体miR-21-5p可抑制巨噬细胞吞噬功能,促进巨噬细胞增殖功能。3.外泌体miR-21-5p可靶向M0型巨噬细胞中PTEN基因,通过PTEN/AKT/STAT6通路促进巨噬细胞向M2型极化。4.外泌体miR-21-5p诱导的M2型巨噬细胞,可通过释放TGF-β因子,激活食管癌细胞的TGF-β/Smad2/EMT通路,促进食管癌细胞的迁移、侵袭能力。