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目的:探讨通过聚乙二醇(PEG)细胞化学融合法构建人脐带血巨核祖细胞/胃癌SGC7901细胞融合体,并通过RPMI1640培养基继续培养使其产生功能性血小板的可行性。这一研究可为临床大量制备血小板提供一种新方法。方法:第一部分:人脐带血干细胞体外扩增为巨核祖细胞及胃癌SGC7901细胞的复苏培养。用免疫磁珠分选人脐带血CD34~+细胞,通过RPMI1640培养基体外静态培养,加入定向分化因子促血小板生成素(TPO)、Flt-3配体(FL)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)产生巨核祖细胞,并对其培养7天(d)的增殖程度进行观察,检测其表面标志CD41、CD61的表达水平;复苏胃癌SGC7901细胞。第二部分:采用PEG化学融合法制备巨核祖细胞/胃癌SGC7901细胞融合体,HAT筛选系统分选融合细胞,继续培养;流式细胞计数仪(FACS)检测培养孔上层液中类血小板颗粒表面CD41、CD62p的表达情况,瑞氏染色观察颗粒形态,血小板聚集试验、粘附试验检测其功能,并与正常单采血小板(保存5d)作比较。结果:1. CD34~+细胞培养及胃癌SGC7901细胞复苏:脐带血CD34~+细胞培养第7d,可见细胞生长旺盛,出现许多集落。胃癌SGC7901细胞复苏第3d,细胞处于对数生长期。2.巨核祖细胞表面标志鉴定:免疫磁珠分选的脐带血CD34~+细胞计数,培养第7d,增殖达80倍,同时流式细胞仪检测其表面标志CD41和CD61,测得其双阳性率第1d为13.59±2.20%,第7d上升至30.66±2.38%。3.细胞融合及类血小板颗粒产生:巨核祖细胞与胃癌细胞融合第1d,倒置显微镜下可见两细胞间部分胞质胞膜已融合,融合部分胞膜完整连续,体积变大,形态规则。融合后第10~d细胞多呈圆形,单个存在,生长状态良好。观察细胞融合率(细胞效靶比:10~:1),融合后细胞计数可达(2.03±1.08)×10~6,融合率为36.91±1.08%。融合细胞培养动态计数:随着培养时间的延长,融合细胞培养10~d,第1、3、5、10~d分别计数,细胞浓度分别为:(5.00±0.00)×10~4/ml、(7.30±0.29)×10~4/ml、(1.50±0.56)×10~5/ml、(2.30±0.93)×10~5/ml,平均增殖约4倍。产生的类血小板颗粒动态计数,第1、3、5、10~d分别为:0、(5.00±0.12)×10~5/ml、(2.60±0.88)×10~6/ml、(6.10~±1.21)×10~6/ml。4.类血小板颗粒鉴定:①形态观察:融合细胞培养10~d,取其培养上层液沉淀颗粒与正常血小板瑞氏染色后比较,其形态相似。②聚集功能鉴定:正常单采血小板和融合细胞培养10d后获得的上层液中沉淀颗粒在未加凝血酶时呈散在分布;加入凝血酶后,两者均发生聚集,且其凝集强度相似,表示类血小板颗粒具有正常血小板相似的聚集功能。③黏附功能鉴定:.融合细胞培养10d产生的类血小板颗粒和正常单采血小板的粘附率分别为40.43±1.63%和35.53±4.06%,两者间无明显差异(t=1.94,P>0.05)。④表面标志测定:融合细胞培养10~d产生的类血小板颗粒和正常单采血小板分别进行血小板表面CD41、CD62p检测,两者CD62p(血小板活化指标)表达相似(t=2.24,P>0.05),CD41表达在类血小板颗粒中明显减少(t=6.59,P<0.05)。结论:1.人脐带血CD34~+细胞在特定的培养体系中可定向分化为巨核祖细胞。2.胃癌SGC7901细胞与巨核祖细胞经化学法诱导融合和选择性培养,可成功获得融合细胞。3.融合细胞通过RPMI1640培养基继续培养可产生类血小板颗粒,且具有与正常血小板相似的功能。