鲜切果蔬是鲜活农产品的一种新型果蔬加工产品,具有“新鲜、营养、方便、安全”的特点,消费者对鲜切果蔬的需求正持续快速增长,在人们日常生活中占据着重要的位置。果蔬在切分、加工过程中,造成人工机械伤害,使果蔬失去原有的保护组织,引发了呼吸速率加快、伤乙烯产生、酶促褐变加剧、产生次级代谢物等一系列生理生化反应。更重要的是切分后的产品组织营养物质外流,极易受食源性病原微生物侵染,而导致食源性疾病的爆发,危害消费者健康和生命安全。目前,常规食源性病原微生物检测方法存在操作步骤繁琐、耗时长的缺点,检测时间为5-7d,而鲜切果蔬货架期和保质期只有3-5 d。可见,常规的检测方法无法满足鲜切果蔬中食源性病原微生物的快速检测和监测。因此,开发鲜切果蔬食源性病原微生物高效、快速检测技术和监控技术是产业发展急需,具有重要的理论和现实意义。本研究以鲜切果蔬为实验材料,以主要引起食源性疾病的五种致病菌,即:单核增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157:H7、鼠伤寒沙门氏菌和副溶血性弧菌为目标菌。研发食源性病原微生物快速检测技术和监控技术,为鲜活农产品的加工、生产、物流过程的安全性提供技术支撑。取得主要研究结果如下:1、揭示了食源性病原微生物在鲜切水果中的生长特性。本实验以六种鲜切水果为研究对象,人工接种污染单核增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌等、大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌,研究了食源性病原微生物在5℃、13℃和25℃下的生长状况。结果表明,单核增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌都可在鲜切水果中显著增长。温度(13℃和25℃)越高生长较快,低温(5℃)下不生长但处于存活状态。金黄色葡萄球菌可以在鲜切菠萝中生长,而其他目标菌在鲜切菠萝中都不能生长。研究证明食源性病原微生物侵染于鲜切水果后,具有很强的生长与繁殖能力,具有引发食源性疾病的风险。温度是影响食源性病原微生物生长的重要因素,也是保障鲜切果蔬安全的重要因素。2、建立了鲜切果蔬食源性病原微生物多重PCR快速检测技术。本研究首先对四种目标菌的毒力基因进行设计及筛选特异性引物,经双正交实验优化了多重PCR反应体系。结果表明,优化的多重PCR反应体系对单核增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157:H7、鼠伤寒沙门氏菌检测的检出限分别为3.5×106cfu/mL、2.4×105cfu/mL、4.8×105cfU/mL和 1.6×105cfU/mL。在初始菌浓度为100、103、106cfu/mL时增菌培养9h后,检出限可以达到100cfu/mL。该技术在人工污染食源性病原微生物于鲜切莴苣、鲜切黄瓜、鲜切木瓜和鲜切哈密瓜等四种鲜切果蔬中的检测研究中得到验证,实现了对四种目标菌同时进行检测。相较于传统的培养检测方法,检测时间由5-7 d缩短至9-12 h。对于专业检测机构或分析检验中心的批量样品检测具有实际意义。3、建立了鲜切果蔬中食源性病原微生物多重荧光定量PCR快速检测技术。针对以核酸检测为基础的分子生物学技术存在无法区分死菌和活菌的缺点,本研究将叠氮溴化丙锭与多重荧光定量PCR技术相结合(PMA-MqPCR),可通过修饰不完整细胞膜的死细胞中DNA,抑制细菌扩增,从而排除假阳性干扰。根据单核增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌四种目标菌的靶基因设计特异性探针,选择HEX、Cy5、FAM和ROX荧光基团修饰四条探针。经过正交实验优化后,建立了可检测四种目标菌的多重荧光定量PCR快速检测技术。检出限分别为5.4×104cfu/mL、1.8×104 cfu/mL、7.3×104cfu/mL和4.2×104cfu/mL。同时,结合快速检测技术研发,还研制了一种可以同时过滤果蔬残渣并收集食源性病原微生物的双层过滤装置。该装置由孔径为15μm尼龙膜和0.22 μn混合滤膜组成。将双层过滤装置与PMA-MqPCR技术相结合,可在不增菌的情况下,对鲜切果蔬中四种食源性病原微生物定量检测,排除假阳性干扰,检出限约为104cfu/g。检测时间约为3-4h。4、建立了食源性病原微生物原位合成基因芯片快速检测技术。采用瓦片式探针设计方式对单核增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌和副溶血性弧菌五种目标菌靶基因进行探针设计与筛选,比对NCBI数据库中五种目标菌的特异性序列,获取靶基因,优化杂交体系。结果表明,对3227条杂交探针进行筛选,最终筛选得到141条特异性探针,即:单核增生性李斯特菌探针数为26条,金黄色葡萄球菌探针数24条,大肠杆菌0157:H7探针数为25条,鼠伤寒沙门氏菌探针数为20条,副溶血性弧菌探针数为46条。将建立的原位合成基因芯片快速检测技术应用于鲜切果蔬食源性病原微生物检测,获得了扩增信号强、准确性高。在未富集培养的情况下,检出限约为103cfu/g,检测时间约为24h。筛选获得的引物和探针具有广谱性和独创性,为DNA微列阵芯片、可视化芯片快速检测技术的研发奠定基础。本研究建立的食源性病原微生物检测技术可在鲜切果蔬原料处理、清洗、鲜切加工、包装、贮藏、物流、销售等全链条中有效对食源性病原微生物检测、监测,并实施防控,提高鲜切果蔬质量与安全控制技术水平。