论文部分内容阅读
DEK蛋白是一种含量丰富、普遍存在的可磷酸化的染色质架构蛋白,主要存在于细胞核的常染色质中,由375个氨基酸组成。DEK蛋白有两个功能性的DNA结合域,一个是位于中心的SAP/SAF DNA结合域,一个是位于C末端的DNA结合域(简写为CDB)。CDB是近年新发现的一个DEK蛋白与DNA的结合域,其中存在多个磷酸化位点,与DEK蛋白的功能密切相关。
DEK蛋白在一些自身免疫性疾病和人类恶性肿瘤中呈过表达,而在某些恶性肿瘤中DEK蛋白低表达。但DEK蛋白在细胞中的功能目前仍不明了,越来越多的研究数据表明,DEK蛋白与细胞凋亡存在一定的关系。
根据文献报道的上述研究结果,我们推测CDB可能在DEK蛋白在细胞中功能的发挥上具有较为重要的作用。本研究以对CDB的研究为切入点,以期为进一步阐明DEK蛋白功能的研究提供线索。
首先,以宫颈癌细胞HeLa细胞cDNA为模板,构建了含有目的基因DEK的质粒pMD18-T-DEK及原核表达质粒pET-30a(+)-CDB,用E.coli BL21(DE3)菌株进行了融合蛋白His-CDB的原核表达及纯化,并研究了其与DNA的结合活性。结果显示,获得了高纯度的融合蛋白His-CDB。复性的融合蛋白His-CDB与DNA结合活性的凝胶迁移阻滞分析结果提示,CDB可与超螺旋型及线性化的DNA结合,但更倾向于与超螺旋型DNA相结合,同全长DEK蛋白具有相类似的特点。
之后,我们构建了分别含有全长DEK、含有核定位序列的CDB、CDB及荧光蛋白基因的真核表达质粒,用转染的方法在真核细胞HeLa细胞中分别过表达目的蛋白,在不同的时间点用CCK-8检测细胞的增殖活性及用Caspase-Glo()3/7 Assay检测细胞凋亡情况,初步的研究结果显示,上述三种目的蛋白的过表达对细胞的增殖有促进作用,对细胞凋亡可能有间接的促进作用。但这一结论还需进一步的实验来验证。
最后,我们用Western blotting的方法检测了Hela、A549、U251、293、Fibroblast(原代培养传代至第六代)、SH-SY5Y六种细胞株中的DEK蛋白的表达水平,以GAPDH为内参,在内参基本一致的情况下,六种细胞株的DEK蛋白表达水平不同。同为肿瘤细胞株的A549 DEK蛋白表达水平较低,成纤维细胞(来源于健康成年人)原代培养传代至第6代的细胞及其它4种细胞株的DEK蛋白表达水平较高,其mRNA水平是否存在差异及可能的表达调节机制需进一步的研究来探讨。
综上所述,本研究首次用原核表达并纯化了CDB并研究了其与DNA的结合活性,继而在细胞水平研究了全长DEK、含有核定位序列的CDB、CDB的过表达对细胞增殖及凋亡的影响,为有关DEK蛋白功能的研究提供新的思路。