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目的：人羊上皮细胞（hAECs）除具有上皮干细胞特性外，还具有神经细胞生物学特性和免疫调节作用，有望成为颇具应用前景的治疗性细胞供源。为了满足治疗所需的细胞数量而进行体外连续扩增必然导致hAECs上皮—间质转化（EMT），这是否会引起hAECs生物学特性的改变，值得深入研究。本研究重点探讨体外连续传代扩增过程中，hAECs的干细胞样分化能力和神经细胞生物学特性是否因EMT而发生改变。方法：①采用胰酶消化法从羊膜分离hAECs，流式细胞术（FCM）和免疫组化染色（IC）鉴定其表型。②FCM和IC分析不同代次hAECs-EMT表型。③实时聚合酶链反应（RT-PCR）检测不同代次hAECs-EMT相关基因的表达。④RT-PCR和FCM检测不同代次hAECs干性基因的表达。⑤RT-PCR、IC和免疫荧光染色（IF）检测不同代次hAECs神经细胞相关基因的表达。⑥酶联免疫吸附试验（ELISA）检测不同代次hAECs培养上清液中神经营养因子含量。⑦生长曲线、CCK8法和FCM分析连续体外传代扩增中不同代次hAECs的生长增殖特性。⑧体外诱导评价不同代次hAECs的分化能力。 结果：①原代（P0）hAECs连续扩增至第5代（P5），不仅其生长增殖能力逐代下降，而且其上皮标志CK19、CD326（Ep-CAM）和E-Cad表达也明显下调（均P﹤0.05），间质标志波形蛋白、CD44和CD105表达明显上调（均P﹤0.05）。②CD44T和E-Cad抗体双染FCM检测结果显示，P0hAECs中上皮表型（E-Cad+/CD44-）占37.6％±5.3%，间质表型(CD44+/E-Cad-）仅有3.7%±1.3%，兼有上皮/间质表型（E-Cad+/CD44+）的达58.7%±4.2%；扩增至P5，上皮表型几乎消失（1.9%±1.2%），间质表型增至28.5%±3.2%，E-Cad+/CD44+表型仍高达67.8%±6.2%。CD326和CD105双染结果进一步显示，随着hAECs扩增代次增加(P0、P3和P5），上皮表型（CD326+/CD105-）显著减少（均P﹤0.05），而间质表型（CD105+/CD326-）明显升高（均P﹤0.05），但上皮/间质表型（CD326+/CD105+）始终维持在54.3%±6.5%~64.8%±6.3%。这些结果表明，hAECs是由表型异质性细胞群组成，且不因体外连续扩增而改变。③P0hAECs经连续扩增后（P3和P5），其上皮相关基因E-Cad、CD14、CK18和CK19mRNA表达逐代明显下调（均P﹤0.05），相反，间质相关基因α-SMA、波形蛋白、PAI1、整合素-β和MMP9表达逐代明显上调（均P﹤0.05）。这些分子生物学证据表明，hAECs在常规体外传代过程中必然发生EMT。④P0、P3和P5hAECs干性基因SOX2、OCT3/4和Nanog mRNA和SSEA4、OCT3/4和Nanog蛋白表达均逐代下调（均P﹤0.05）,但是，这些干性标志物在P5hAECs并未完全消失，仍有不同程度的表达；在体外诱导条件下，P0、P3和P5hAECs均能分为成骨、软骨和脂肪细胞。这些证据表明，hAECs并不因EMT而丧失其干细胞分化能力。⑤P0、P3和P5hAECs神经细胞相关基因RC1、NeuN、NF、DARP32、GFAP、NGF、BDNF和NT-3mRNA均有表达，且也都分泌神经营养因子NGF、BDNF和NT-3，其表达水平代次间无明显差别（均P﹥0.05），说明hAECs并不因EMT而丧失其神经细胞生物学特性。 结论：①hAECs不是均质性细胞群，是由表型异质性细胞组成；②在连续扩增过程中hAECs必然发生EMT，但其干细胞样分化能力和神经细胞生物学特性并不随EMT的演进而丧失，提示常规体外传代扩增的hAECs仍适合于相关疾病的细胞治疗。