半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit.)是单子叶天南星科半夏属植物,以块茎入药,具有燥湿化痰,降逆止呕,消痞散结的功效及抗早孕、抗溃疡、抗心律失常、降血脂、镇静催眠、解毒抗炎以及抗癌等药理作用,是我国重要的常用中药,其主要成分有多糖、生物碱、甾醇以及凝集素等。近年来,植物凝集素的研究得到飞速的发展,尤其是甘露糖特异性的天南星科植物凝集素被发现可在哺乳动物的很多重要的生理过程中发挥重要的作用,半夏蛋白(Pinellia ternataagglutinin,PTA)作为一个很有潜力的抗肿瘤甘露糖结合凝集素也逐渐受到人们的关注,但是目前其结构仍未得到解析,若能够对半夏蛋白的结构进行解析,对半夏蛋白的深入研究具有较大的意义。　　 此外,半夏属植物还具有一些较为独特的生物学特征,比如半夏可通过块茎、种子等繁殖之外,还可以在叶茎、叶底和块茎上长出珠芽进行繁殖,这种现象即使在天南星科植物中也是少见的;而掌叶半夏(Pinellia pedatisecta Schott.)在半夏属中也比较独特,它是本属唯一叶片呈掌状,块茎最大的植物。植物miRNA作为基因表达的负调控因子在植物生理过程的各个方面均扮演着重要的作用。然而,目前仍未见半夏属植物miRNA的相关报道,若对半夏以及掌叶半夏miRNA进行研究,将为植物miRNA在这两种植物的生命活动及半夏蛋白的表达的调节等的研究提供一定参考。　　 在本研究中,我们通过硫酸铵沉淀、亲和层析色谱、分子筛凝胶层析色谱、离子交换层析色谱、疏水层析色谱等方法从半夏块茎中分离纯化适合于蛋白质结晶的半夏蛋白样品。首先根据前期的实验基础利用75％的硫酸铵从半夏块茎的匀浆收集液中盐析出蛋白质成分,然后利用Mannose-Sepharose4B亲和层析色谱技术从硫酸铵沉淀的蛋白质成分中截留富集甘露糖特异性结合的半夏蛋白成分,此步回收的蛋白质样品纯度较高,仅含有少量的杂质,接着使用SuperdexTM75分子筛层析色谱技术从蛋白质分子量以及分子形状上进一步纯化半夏蛋白样品,经SDS-PAGE蛋白电泳发现回收的蛋白质样品达到电泳纯,该纯度已达到蛋白质结晶的要求,但在使用Mono QTM离子交换层析色谱分析该蛋白质的电荷均一性的时候发现杂峰很多,因此我们收集峰值最大的色谱峰,并利用HiTrapTM Phenyl HP疏水层析色谱技术对其进行更进一步的纯化,利用SDS-PAGE以及Native-PAGE电泳技术进行分析发现该蛋白质样品在分子量大小、分子形状、电荷以及表面疏水性等方面均达到均一性。并且利用MS证实该蛋白质为PTA。利用倍比稀释法对纯化的半夏蛋白进行凝血活性测定发现其对小鼠的血红细胞具有显著的凝集作用,最小凝集浓度为0.012mg/mL。本研究还利用悬滴蒸汽扩散结晶法对该蛋白进行结晶,通过初始结晶条件的筛选、结晶条件的优化,最后成功的在存在配基和不存在配基的情况下获得了半夏蛋白的晶体。在本研究中我们还通过构建原核表达载体pET28a-pta以及重组家蚕杆状病毒Bacmid/BmNPV/pta成功的在大肠杆菌、家蚕细胞及家蚕蛹中表达了半夏蛋白,并初步对原核表达系统表达的半夏蛋白包涵体尝试了透析复性以及柱上复性,复性产物的溶解度有所增加但是均一性不佳,仍需要进一步的优化以达到适合结晶的标准;同时,还对家蚕蛹表达的可溶性半夏蛋白进行了纯化,在分子大小和形状上均一性较好,但是回收量太低,在今后的研究中还需对其表达量以及纯化工艺进行优化研究。　　 同时,本研究还通过利用微流体miRNA芯片、RT-PCR以及Real-time PCR对半夏以及掌叶半夏miRNA进行了初步的研究,我们利用微流体miRNA芯片从半夏中总计检测到了54条非冗余的保守miRNA,隶属于23个miRNA家族,在掌叶半夏中检测到了99条miRNA,隶属于22个miRNA家族,其芯片结果均得到RT-PCR的验证,利用Real-time PCR对检测的miRNA进行分析发现它们在不同的组织中的积累量是不同的。这为对半夏属植物miRNA进行更深入的研究提供了基础。