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I型糖尿病是一种自身反应性T细胞介导的自身免疫性疾病,主要机制为自身免疫性淋巴细胞浸润胰岛杀伤胰岛β细胞,引起胰岛素分泌绝对不足从而导致糖尿病。I型糖尿病以CD4+T细胞和CD8+T细胞主导,同时有多种淋巴细胞如NK细胞,NKT细胞,γδT等细胞参与I型糖尿病疾病进程。近年,国内外研究均证实NKG2D表达不仅表达在NOD小鼠NK细胞表面,而且在其CD4+T细胞和CD8阳性T细胞表面表达,同时Th17细胞在NOD小鼠I型糖尿病中发挥重要的炎症性作用。本课题利用流式细胞术动态检测NOD小鼠CD4+T细胞的NKG2D、IL-17表达情况,以及其他细胞因子、核转录因子的表达,推测CD4+NKG2D+T细胞的功能和表型特征。第一部分:NOD小鼠CD4+T细胞表达NKG2D与I型糖尿病病程有关目的:动态监测NOD小鼠体内血糖变化,以及CD4+NKG2D+T细胞频率,阐明CD4+NKG2D+T细胞与I型糖尿病之间的关系。方法:在NOD小鼠12周龄开始每周监测外周血血糖变化情况。另外在8w,10w,12w,14w每隔2周流式细胞术检测小鼠外周血CD4+NKG2D+T细胞的变化频率。对血糖以及CD4+NKG2D+/CD4+的细胞频率进行统计,分析NKG2D表达的CD4+T细胞与I型糖尿病的相关性。结果:NOD小鼠血糖随疾病进程逐渐增加,在28周龄达到最高。发病率统计结果显示在12周龄开始有小鼠发病,在28周龄时比率达到最高。流式细胞技术分析CD4+NKG2D+T细胞随I型糖尿病发展逐渐增加,在发病期细胞频率达到最高。说明CD4+NKG2D+T细胞与NOD疾病进程有关。第二部分:NKG2D+CD4+T细胞表型特征与功能分析目的:检测CD4+NKG2D+T细胞膜分子表达和分泌细胞因子,推测CD4+NKG2D+T细胞的功能和表型特征。方法:随小鼠疾病发展,按照15w,20w,25w,30w周龄通过流式细胞术检测CD4+NKG2D+T细胞膜分子表达和IL-17,INFγ,IL10等细胞因子表达情况进行检测。结果:NOD小鼠疾病前驱期IL17分泌水平逐渐增高到发病期达到最高。IFNγ疾病前驱期和发病期分泌水平一直处于较高状态。FasL,CD107a在疾病前驱期和疾病期低分泌或不分泌,推测CD4+NKG2D+T细胞没有细胞毒活性。IL10分泌水平在整个病程过程中低分泌有可能没有调节活性。CD25和CD69表面蛋白均有表达,说明CD4+NKG2D+T细胞处在激活状态。在疾病前驱期和疾病期随病程中CD4+NKG2D+T细胞分泌IL17水平逐渐提高,推测与Th17细胞具有一定相似性。CD4+NKG2D+T细胞不具有细胞毒作用以及免疫调节作用。第三部分:CD4+NKG2D+IL17+T细胞特征性分析目的:通过流式细胞术分析CD4+NKG2D+IL17+T细胞的特征,推测CD4+NKG2D+T细胞与Th17细胞之间的关系。方法:按照小鼠疾病前驱期到30w以后疾病期,通过流式细胞术动态检测小鼠外周血CD4+NKG2D+T细胞中转录因子RORyT,胞内因子TGFβ,以及膜表面分子NK1.1,CCR6的表达水平,推测CD4+NKG2D+IL17+T细胞与Th17细胞之间的关系。结果:在疾病前驱期NOD小鼠外周血CD4+NKG2D+T细胞中RORγT表达逐渐提高,到发病期达到高峰,TGFβ水平较低,由于个体差异较大,没有统计学意义。疾病前驱期与疾病期相比CCR6分泌水平增高。CD4+NKG2D+T细胞表达NK1.1情况在发病期较发病前驱期有显著增加,但是主要是CD4+NKG2D+NK1.1-胞为主。所以,CD4+NKG2D+T细胞是一群与Th17细胞功能相似的细胞。疾病前驱期和疾病期表达RORγT,但是促进Th17细胞分化的TGFβ低分泌,CD4+NKG2D+表面NK1.1主要为阴性,高表达CCR6,可以推测CD4+NKG2D+T细胞在I型糖尿病病程起到炎症作用,同时与Th17细胞功能相似,但是并不是同一群细胞。