论文部分内容阅读
目的分离、获取大鼠骨髓单个核细胞,条件培养基诱导成血管内皮祖细胞,观察体外培养主要生物学特点,免疫组化及免疫荧光鉴定。在体外制备猪脱钙骨基质支架,电镜扫面观察组织形态。将血管内皮祖细胞种植在脱钙骨基质支架上,将细胞-支架复合体置于生物型压力反应器给予适当压力干预,观察其形成血管能力。方法取50克Wistar大鼠,采用密度梯度离心法结合差速贴壁筛选法分离出骨髓单个核细胞,用条件培养液从原代开始诱导培养,诱导其形成血管内皮祖细胞,并对诱导细胞进行免疫组化及免疫荧光鉴定。取适当大小猪脊柱椎体松质骨,通过组织固定、脱脂、脱钙等步骤制备出脱钙骨基质支架。取第三代血管内皮祖细胞种植在脱钙骨基质支架,将细胞-支架复合物随机分为A、B两组,A组置放在生物型压力反应器,给予1Hz频率,5%形变压力值,五天后将细胞-支架复合物取出,继续培养直至两周,B组直接培养两周,观察两组支架上的细胞血管形成能力。RT-PCR检测两组EPCs分化相关因子mRNA表达。结果新提取的细胞呈圆形,大小不一。24小时差速贴壁,36小时后可见部分细胞贴壁,并逐渐出现梭形、三角形、纺锤形或不规则形等形态。7天左右出现细胞集落,中央呈圆形,周围梭形细胞放射性生长。10～12天集落细胞呈单层铺路石样生长。细胞-支架复合物电镜下可见脱钙骨基质孔隙网架结构,骨小梁、小梁间隙和骨内管腔系统同时存在,细胞铺满材料表面,临近细胞相互融合。A、B两组HE染色和荧光染色可见血管束形成,且A组细胞明显多于B组。用RT-PCR法检测两组EPCs培养后vWF和Flk-1 mRNA的表达情况,A组表达明显强于B组。结论密度梯度离心法结合差速贴壁法提取血管内皮祖细胞简便、快捷,生长状态稳定,增殖能力强。可以认为血管内皮祖细胞是一种理想的骨组织工程种子细胞。脱钙骨基质是一种良好的载体支架材料,与血管内皮祖细胞复合构建组织工程骨给予适当压力干预后能明显促进移植骨的血管化,在修复骨缺损方面具有临床应用价值。