论文部分内容阅读
目的：重金属铅是一种普遍存在的环境神经毒物,低浓度的慢性铅暴露对婴幼儿中枢神经系统不可逆的损害以及对学习记忆能力的影响是一个备受关注的重大问题。婴幼儿的消化道对铅的吸收率较成人约高5倍,而排泄率较成人低,加之儿童血脑屏障发育不全,因此铅极易在神经系统产生蓄积。0～6岁儿童的大脑智力发育对铅的敏感性高于成30倍,我国很多城市儿童铅中毒已达到30～40％,是美国儿童的10余倍。研究表明当儿童的血铅由0.48μmol/L升高到0.97μmol/L时,智商平均下降2～6分。
海马是大脑学习和记忆的关键部位。海马长时程增强(Long TermPotentiation,LTP)由于本身具有协同性、联合性、特异性等特点,使它成为信息储存和记忆的细胞机制。研究发现,缺氧、低糖、重金属等应激信号可以使海马神经元细胞受到损伤。当应激强度过大,海马神经元细胞功能严重受损时细胞将启动生长抑制DNA损伤诱导因子(growth arrest and DNA damageinducible gene,GADD153)等信号触发细胞凋亡。
大量的动物实验研究表明,海马是铅损害大脑的主要作用靶点之一。细胞周期的调节是细胞生长阶段的一个重要环节。许多细胞毒性和遗传毒性因子可阻断细胞周期并导致细胞死亡。研究表明,铅是一种细胞毒性因子可引起不同类型的细胞产生细胞毒性。
本实验预在体外原代培养的海马神经元细胞中证明铅可导致海马神经元细胞形态及功能的损伤;探讨铅对海马神经元细胞DNA的损伤及其对细胞周期的阻断程度;以及铅诱导cyclin D1的表达是通过何种信号途径进行的以及这些信号途径中的某些信号分子的改变,从而进一步探讨铅中毒时海马神经元细胞的变化对学习记忆损伤的影响机制。
方法：
1、Wistar大鼠脑海马神经元细胞的原代培养,分别加入醋酸铅培养不同时间及不同浓度,加入醋酸钠作为对照。
2、流式细胞技术分析醋酸铅对海马神经元细胞的细胞周期进程的影响。
3、MTT比色法观察醋酸铅对海马神经元细胞增殖的影响。
4、通过SOD、GSH-Px、CAT、TChE及MDA试剂盒检测铅对海马神经元细胞氧化应激水平的影响。
5、Western blot方法检测醋酸铅诱导的CyclinD1和GADD153蛋白表达变化。
6、彗星实验检测大鼠海马原代培养神经细胞DNA损伤程度。
7、倒置相差显微镜观察细胞形态。
8、RT-PCR检测GADD153的mRNA表达。
结果：
1、MTT比色法结果显示:细胞经染铅处理后细胞增殖比明显降低,且与铅的水平呈时间依赖关系,10μM/L醋酸铅处理细胞4天起,细胞增殖比下降具有统计学意义(P＜0.05)。
2、流式细胞技术结果显示:随着染铅浓度的增加,可观察到有细胞阻断情况发生。在原代培养的海马神经元细胞S相过程中尤为显著。如下图所示,当原代培养海马神经元细胞染铅浓度为0.2μmol/L时,细胞周期阻断情况不显著(sub-G1,S,G0/G1,and G2/M),当染铅浓度增加到1.0μmol/L和and10μmol/L时,S和sub-G1期细胞周期阻断情况显著。
3、Western blot结果显示:
(1)随着染铅浓度0.2,1.0和10μmol/L的增加,CyclinD1蛋白表达与对照组相比逐渐降低。从染铅0.2μmol/L开始,CyclinD1蛋白表达下降有统计学意义(P＜0.05),染铅1.0和10μmol/L时,CyclinD1蛋白表达下降有显著统计学意义(P＜0.01)。
(2)用Western blot方法检测不同浓度染铅组GADD153蛋白表达值:醋酸铅终浓度分别为0.2、1.0、10μM/L。结果显示只有10μM/L醋酸铅诱导的GADD153蛋白表达增加具有统计学意义(P＜0.05)。
(3)10μM/L醋酸铅呈时间依赖性刺激海马神经元细胞GADD153蛋白表达增加。醋酸铅作用24 h后GADD153蛋白表达已经开始升高,染铅8天时达峰值。
4、彗星实验结果显示:醋酸铅组中的DNA的尾距(OTM)和彗尾值(％tail)相比对照组,醋酸铅1.0和10μmol/K组明显高(P＜0.05)。醋酸铅0.2μmol/L组的彗尾高于对照组,差异无显著性意义(P＞0.05)。
5、石墨炉原子吸收法结果显示:
(1)醋酸钠对照组海马神经元细胞GADD153纯化产物中铅含量无明显改变;
(2)与对照组相比,10μM/L醋酸铅处理的海马神经元细胞的GADD153纯化产物中铅含量的改变趋势与GADD153蛋白表达的改变趋势相同。醋酸铅作用12 h时纯化产物中铅含量已经开始升高,染铅8天时达峰值。
6、原代培养大鼠海马神经元细胞的过氧化损伤检测结果显示:
(1)染铅后海马神经元细胞SOD活力检测结果显示出不同浓度醋酸铅作用海马神经元细胞12h后,各染毒组与对照组比较SOD活性分别下降35.6％、47.8％、52.2％和56.7％,组间比较差异不显著(P＞0.05);
(2)染铅后海马神经元细胞GSH-Px活力检测结果显示出不同浓度醋酸铅作用海马神经元细胞12h后,各染毒组与对照组比较,GSH-Px活性均显著降低(P＜0.05),与对照组比较,从低剂量到高剂量,各染毒组GSH-Px活性分别下降17.6％、25.5％、37.8％和46.2％,组问差异显著(P＜0.05);
(3)染铅后海马神经元细胞CAT活力检测结果显示出不同浓度醋酸铅作用海马神经元细胞12h后,各染毒组与对照组比较,CAT活性含量则显著升高(P＜0.05)。与对照组比较,从低剂量到高剂量,各染毒组CAT活性分别升高27.8％、63.8％、112.5％和117.8％,当铅作用浓度在200μmol/L以下时,组间差异显著(P＜0.05),而在200μmol/L以上时组间表现差异不显著(P＞0.05);
(4)染铅后海马神经元细胞TChE活力检测结果显示出不同浓度醋酸铅作用海马神经元细胞12h后,各染毒组与对照组比较,TChE活性分别下降22.5％、37.4％、42.9％和53.7％,组间比较有显著差异(P＜0.05);
(5)染铅后海马神经元细胞MDA活力检测结果显示出不同浓度醋酸铅作用海马神经元细胞12h后,各染毒组与对照组比较,MDA含量则显著升高。与对照组比较,从低剂量到高剂量,MDA含量分别升高了54.9％、117.2％、322.5％和342.7％(P＜0.05或P＞0.05)。
7、RT-PCR检测GADD153的mRNA表达结果显示:与对照组相比,10μM/L醋酸铅呈时间依赖性刺激海马神经元细胞GADD153 mRNA表达增加。醋酸铅作用12 h时GADD153 mRNA表达已经开始升高(为对照的1.58倍),染铅24h时达峰值(为对照组的2.16倍)。
结论：
1、染铅后海马神经元细胞SOD活性下降,染铅后海马神经元细胞GSH-Px活性显著降低,染铅后海马神经元细胞CAT活力含量则显著升高,染铅后海马神经元细胞TChE活力显著下降,染铅后海马神经元细胞MDA活力含量则显著升高。
2、在原代培养的鼠海马神经元细胞中,铅进入海马神经元细胞后可抑制细胞增殖,铅进入海马神经元细胞后可改变正常细胞形态和数量,可使海马神经元细胞的细胞周期停滞在G1期,并可抑制CyclinD1蛋白表达。
3、铅进入海马神经元细胞后可诱导GADD153大量表达,进入海马神经元细胞后可使其发生DNA损伤,海马神经元细胞的GADD153纯化产物中铅含量的改变趋势与GADD153蛋白表达的改变趋势相同。