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辅酶Q<,10>,一类脂溶性醌类化合物,以极低的含量广泛存在于动物、植物、微生物等细胞内。作为呼吸链中的递氢体,在生物体中具有重要的生理功能,是细胞内天然抗氧化剂,细胞代谢的激活剂,并能够提高机体免疫力,在临床中有着广泛的用途。本文以热带假丝酵母AS 2.1387为出发菌株,对辅酶Q<,10>高产菌进行了诱变选育,并对其发酵条件,提取工艺进行了各方面的优化,大幅度提高了辅酶Q<,10>的发酵单位,主要研究结果有以下几个方面:
1.研究了紫外线、硫酸二乙酯单因子,以及复合因子对出发菌株的诱变效应,硫酸二乙酯一紫外复合诱变是抗性高产菌育种的最佳诱变方式,其最适剂量为1%的DES处理40min,再经紫外处理60s,致死率与突变率分别为91.5%与2.71%;在营养缺陷型突变菌的选育中,硫酸二乙酯单因子诱变为最佳的诱变方式,最适剂量为1%的DES处理40min,突变率达到2.3%。通过放线菌素D对突变菌进行广谱抗性初筛,并以高浓度前体物质对羟基苯甲酸以及终产物结构类似物维生素K<,3>进行特异性筛选,最终选育得到了一株遗传稳定性良好的辅酶Q<,10>高产突变株APV.12,其发酵产量达到了23.958mg/L,比出发菌株提高了1.76倍。
2.本课题对辅酶Q<,10>高产突变株APV.12进行了一系列的发酵工艺优化,得出最佳发酵培养基组分为:葡萄糖3.5%、酵母膏0.6%、蛋白胨0.4%、(NH<,4>)<,2>SO<,4> 0.1%、玉米粉0.1%、MgSO<,4>-7H<,2>O0.05%、K<,2>HPO<,4>0.05%、KH<,2>PO<,4>0.1%、CaCl<,2>0.1%、NaAc0.2%。研究了对羟基苯甲酸、胡萝卜汁、番茄汁三种添加物质对热带假丝酵母发酵生产辅酶Q<,10>的具体影响,并确定了其最适添加量,各因素的最佳组合为:PHB:0.15%,胡萝卜汁:0.6%,番茄汁:0.4%。
3.通过发酵工艺优化,得出辅酶Q<,10>高产突变株APV.12最佳发酵条件为:温度30℃,pH6.0,接种量6%,250ml锥形瓶中装液量60ml,发酵时间48h。优化后的菌体生物量和辅酶Q<,10>发酵单位均高于优化前,辅酶Q<,10>发酵单位达到了28.102mg/L,比优化前提高了17.3%;APV.12菌株的发酵单位最终比出发菌株AS 2.1387提高了2.24倍。
4.对辅酶Q<,10>的提取纯化工艺进行了各方面的优化,最适提取条件为:浓度2mol/L的氢氧化钠溶液破壁并皂化,皂化温度90℃,回流时间为60min,石油醚萃取后的皂化液中的菌体残渣用丙酮进行再处理;提取工艺优化后辅酶Q<,10>的得率较优化前提高了58.9%;粗提液经硅胶柱层析纯化后,杂质含量减少,纯化样品中辅酶Q<,10>的含量达到98.16%。
5.对辅酶Q<,10>的检测进行了研究,比较了UV法、TLC-UV法与HPLC法三种检测方法的相关性,并对其检测结果进行了验证,确定以UV法作为育种与发酵优化实验中的快速检测方法,可以采用TLC-UV法进行定量分析,其检测结果与HPLC法相差9.2%,在常规实验条件下能够对辅酶Q<,10>的发酵单位进行准确的检测。