油菜是世界上四大主要油料作物之一,属于十字花科芸薹属。油菜3个栽培种之一的甘蓝型油菜(2n=38,AACC)是遍及世界的重要油料作物,也是我国最大的油菜籽作物。在提高单产的同时提高油菜籽的含油量和品质一直是当代油菜育种的核心目标,黄籽油菜较相同遗传背景下的黑籽油菜有含油量高、种子种皮薄、色素杂质少和菜油品质好等优点,因此油菜黄籽性状是油菜育种中一个重要的育种目标。甘蓝型油菜虽然是三种油菜栽培种中籽粒产量最高的种类,但缺乏天然的甘蓝型油菜黄籽材料。甘蓝型油菜籽粒颜色与类黄酮生物合成这个次生代谢途径高度相关,深入研究甘蓝型油菜类黄酮途径,不仅有助于深入理解甘蓝型油菜种皮颜色的形成机制,而且对于甘蓝型油菜黄籽育种目标具有重要意义。在本研究中,我们对甘蓝型油菜种子类黄酮生物合成调控相关的一个调控因子BnTT1进行了转基因功能鉴定。主要结果如下:1 BnTT1基因家族RNAi转基因表型转基因甘蓝型油菜4个株系生长发育较中双10号野生正常株系迟缓,苗期的转基因株矮小,且抽薹开花延迟,花后的转基因株系可以正常授粉结籽,末花期的转基因株能达到中双10号正常株的株高,但分枝数减少。种子表型调查显示转基因株系成熟种子呈黄色、籽粒小、千粒重低(平均下降了26.67%),种子显微切片显示转基因株系发育中种子和成熟种子的种皮都变薄。2 BnTT1基因家族调控类黄酮生物合成和影响油菜种子发育在我们对甘蓝型油菜的研究中,BnTT1基因家族的沉默抑制导致转基因油菜成熟种子呈现黄色并伴随种子变小、千粒重下降和种皮变薄等一系列转基因特征。对转基因发育中种子的解剖观察显示转基因发育中种子的内种皮和外种皮都变薄,油菜内种皮和外种皮的解剖显示共有五层细胞层,一层表皮细胞层(表皮层)和三层栅栏细胞层(栅栏层)构成外种皮,一层内皮细胞层(内皮层)构成内种皮。在发育中种子的比较中,我们发现转基因种子栅栏层的细胞变小变薄,导致转基因种子栅栏层变薄,连同变薄的内皮细胞层一起促成转基因种子种皮变薄。这些结果表明,BnTT1基因家族可以影响油菜种子栅栏细胞层和内皮细胞层的形态发育。同时,香草醛和TBO的染色结果显示转基因种子的种皮儿茶素和酚类化合物积累下降。RNA-seq比较分析显示转基因种子中大量参与类黄酮生物合成的基因表达发生了改变,同时,qRT-PCR分析显示转基因种子中CHS/TT4、DFR/TT3、LDOX/TT18、ANR/BAN、TT12、CFI/TT5、F3H/TT6和GSTF12/TT19等类黄酮生物合成与运输相关的关键基因表达发生了显著下调,作为这些类黄酮生物合成基因表达下调的后果,转基因油菜种子类黄酮如表儿茶素、槲皮素及其衍生物(Qn-3-O-sophoroside,Qn-3-O-glucoside-1)、异鼠李素及其衍生物(Is-3-O-glucoside,Is-3-O-glucoside-7-O-glucoside)、山萘酚衍生物(Km-3-O-glucoside-7-O-glucoside)、可溶性原花青素(原花青素B2[DP 2]、[DP 2]-2、[DP 3]、[DP 3]-2、[DP 4])和不溶性原花青素含量均显著低于中双10号对照种子,这些结果表明BnTT1基因家族调控类黄酮生物合成,BnTT1的功能缺失导致类黄酮合成与运输一系列关键基因表达的下调,导致表儿茶素及其低聚物积累水平显著下降,最终促成转基因种子的颜色变化。调查还显示,在CHS/TT4,DFR/TT3,LDOX/TT18,ANR/BAN,TT12,CFI/TT5,F3H/TT6以及GSTF12/TT19等主要的类黄酮生物合成与运输基因表达显著下调的同时,一些类黄酮晚期生物合成基因如LAC15/TT10以及一些UGT(包括UGT73B3、UGT73B2、UGT73C5和UGT73C1)的表达发生显著上调,LAC15等基因表达虽然显著上调,但是不溶性原花青素水平还是下降了,表明原花青素前体物质如表儿茶素的含量严重不足。以上成分分析和定量PCR证据共同表明,油菜BnTT1家族在调控种皮色素的同时也调控种胚黄酮醇积累,油菜BnTT1家族器官组织表达特异性分析显示油菜TT1不仅在种皮中优势表达,而且在种胚中也显著表达,意味着BnTT1基因家族可能直接参与调控油菜种胚的发育和代谢。另外,解剖观察显示油菜不仅内种皮变薄,而且种皮的主要实体部分——栅栏层也变薄,暗示在甘蓝型油菜中BnTT1不仅参与内种皮发育,对外种皮发育也有影响。3 BnTT1基因家族影响公共苯丙烷途径基因的表达RNA-seq对比分析显示转基因系苯丙烷途径基因表达谱发生了显著改变,其中参与公共苯丙烷途径的三个酶基因表达均发生了不同程度的下调,qRT-PCR分析显示PAL、C4H和4CL基因总体表达均显著下调,但各基因各员之间却有着不同的表达模式,提示成员之间可能具有不同的功能分工,同时BnTT1基因家族的沉默对公共苯丙烷途径基因表达的影响具有选择性,如4CL基因家族成员中仅对参与类黄酮生物合成的4CL3的表达造成影响,由此可以推测BnTT1选择性调控参与类黄酮生物合成的基因成员。4沉默BnTT1基因家族会明显上调种皮木质素生物合成木质素途径是苯丙烷途径的分支途径,DEG分析显示木质素途径基因表达谱明显发生了变化,主要表现在β-葡糖苷酶基因家族和过氧物酶基因家族以及HCT、CAD、F5H1、UGT84A等基因,qRT-PCR调查显示转基因种子中C3H、CAD、CCo AOMT、F5H、F5H1和UGT84A等基因表达发生了轻微的上调,而COMT1、CCo AOMT1等基因则发生了轻微的下调,总体上表现为上调,作为这些基因表达变化的影响,转基因种子木质素含量水平也发生轻微的变化,表现为一定程度但达到显著水平的上升,表明BnTT1基因家族沉默对木质素合成与代谢造成的影响较轻,有可能是类黄酮分支途径物质流的严重下降导致竞争性旁支途径——木质素途径物质流显著增加,木质素途径基因表达相应上调,种皮木质素合成与积累含量上升。5 BnTT1基因家族影响脂肪酸生物合成与代谢作为一类脂肪族羧酸,脂肪酸在植物种子中分布广泛,在植物的整个生命周期发挥着重要的作用。目前TT1在种子脂肪酸生物合成和代谢中所扮演的角色与功能仍然未知。在这项研究中,我们发现BnTT1基因家族的表达抑制导致脂肪酸组分发生显著的改变,包括C18:1含量的下降(-12.41%)和C18:2、C18:3含量的增加(+30.08%,+25.59%),同时,总脂肪酸含量没有明显改变。伴随着这种成分变化,编码质体和内质网中脂肪酸生物合成关键酶的基因群表达谱表现出相应的改变,包括ω-6脂肪酸去饱和酶基因FAD6、ω-3脂肪酸去饱和酶基因FAD3和硬脂酰-ACP脱氢酶基因AACPD等基因。FAD6和FAD3基因表达的显著上调,很可能分别是转基因种子C18:2和C18:3脂肪酸明显增加的原因。AACPD2、AACPD3和AACPD5等基因小幅上调,则导致C18:0脂肪酸轻微上调。β-酮脂酰-ACP合成酶基因KASII表达的轻微下调,则可能是C16:0脂肪酸略微增加的原因。调查显示转基因种子总脂水平没有明显变化,相应的,ACCase酶两个同聚型基因ACC1、ACC2及异聚型四个亚基基因表达均没有变化。此外,在种子的成熟过程中调节脂肪酸生物合成的关键转录因子基因,B3结构域转录因子ABI3、核转录因子L1L和LEC1表达显著上调,因此推测BnTT1是ABI3、LEC1和L1L等脂肪酸生物合成调控基因的潜在调控子,BnTT1功能缺失导致ABI3、LEC1和L1L表达异常,进而改变了FAD6、FAD3、KASII和AACPD等基因的转录水平,最终导致脂肪酸组分和种子发育的改变。这些结果暗示油菜TT1除调控类黄酮次生代谢外可能也参与种子脂肪酸初生代谢。6 BnTT1基因家族对甘蓝型油菜植株生长发育的影响转基因株系苗期到花期的生长发育调查显示转基因株系较中双10号对照生长发育延迟,形态上发苗60d的转基因植株明显比同期的中双10号对照矮小,抽薹开花也相应延迟5-10d左右,成熟的转基因植株在株形和株高上与中双10号对照没有显著性差异,但分枝数减少,这些现象提示BnTT1基因家族可能参与调控油菜植株的生长发育。但BnTT1基因器官组织表达特异性分析显示BnTT1在油菜营养器官根、茎、叶中并没有表达,因此推测转基因株系苗期生长发育迟缓并不是BnTT1基因家族被沉默后的直接影响,而且,转基因各株系植株在生长发育的末期都可以达到中双10号正常株的株高,此外,组培的转基因T1代也未能观测到这个表型差异,因此,我们推测,T2、T3代转基因株系植株之所以生长发育较缓慢,很有可能是因为转基因种子发育不良,转基因种子籽粒显著小于中双10号正常种子,种子内代谢组分如类黄酮物质,尤其是黄酮醇水平大幅度下降,种子发育异常以及物质储备较少导致种子萌发以及后期的生长发育异常,即种子大小、种子结构和种子成分改变导致的间接效应,受此负效应影响,转基因植株苗期生长发育迟缓,抽薹开花也晚于野生正常株,最后所能产生的分枝也相应减少。