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研究背景:病毒可以调控自噬以完成复制和释放等病毒生命周期过程中的关键步骤,也可以通过自噬选择性地降解与抗病毒反应相关的免疫复合物,以此躲避宿主抗病毒免疫反应,促进病毒的复制。应激颗粒（Stress granule,SG）是细胞受到包括病毒感染在内的刺激时细胞内转录停滞的RNA与RNA结合蛋白相互结合形成巨大复合物。SG除了具有阻滞基因转录功能外,还可介导包括维甲酸诱导基因I（Retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I）信号在内的一些重要的天然免疫反应信号通路的激活。研究者在神经退行性疾病的研究中发现,自噬能够选择性降解SG,这种现象称为“粒噬”（Granulophagy）。然而,目前这一细胞生物学现象是否存在于病毒感染过程中尚不清楚,更不了解粒噬在病毒感染过程中的作用。原型泡沫病毒（Prototype foamy virus,PFV）是一种复杂的逆转录病毒,属于逆转录病毒科（Retroviridae）泡沫病毒亚科（Spumaretrovirinae）,在感染宿主后能够终身潜伏感染,这依赖于该病毒对IFN-I（Type I interferon,IFN-I）反应的抑制作用。然而,关于PFV持续潜伏感染的机制,特别是关于抑制IFN-I反应的机制,目前知之甚少。有研究表明,PFV能够诱发自噬。然而,PFV诱导的自噬的机制及其在持续潜伏性感染中的作用尚不明了。逆转录病毒的Gag蛋白参与病毒衣壳组装和病毒出芽等病毒复制活动。PFV-Gag蛋白能够与Alix（Apoptosis-linked gene 2 protein（ALG-2）interacting protein X,凋亡相连基因2蛋白互作蛋白X）相互作用来募集转运必需内体分选复合物I（Endosomal sorting complex required for transport I,ESCRT-I）参与到病毒出芽过程中。复合物ESCRT能够介导晚期内体形成进而促进内体相关性自噬的发生。但是,逆转录病毒的Gag蛋白能否引发内体相关性自噬以及该过程是否与其募集ESCRT-I相关尚不明确。研究目的:首先,明确PFV诱导自噬及其对IFN-I反应的调节作用。其次,确认PFV-Gag蛋白能够诱发内体相关性自噬并探究其与Alix相互作用促发自噬的机制。最终,探查PFV-Gag蛋白引发的内体相关性自噬对降解SG,抑制IFN-I反应的作用。研究方法:1.PFV感染HT1080细胞后利用Western Blot检测HT1080细胞中LC3脂化和p62降解;PFV感染表达GFP-LC3的HT1080后检测细胞中GFP-LC3的点状聚集,通过以上实验观察PFV能否引起发细胞自噬。2.应用RNA干扰技术抑制HT1080细胞中Atg5的表达,以抑制自噬的启动;或者使用巴佛洛霉素A1（Bafilomycine A1）处理细胞以抑制自噬体和溶酶体的融合,感染PFV后应用双荧光素酶报告基因实验（Dual-luciferase reporter assay）检测IFN-β的启动子活性,使用逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）检测干扰素刺激基因56（Interferon-stimulated gene 56,ISG56）的转录水平,通过以上实验观察PFV引发的自噬对IFN-I反应的调节作用。3.应用真核生物基因表达技术在HEK293T细胞中表达PFV-Gag蛋白,使用Western Blot检测HEK293T细胞中LC3脂化和p62降解;应用真核生物基因表达技术在HEK293T细胞中表达GFP-LC3和PFV-Gag蛋白,使用荧光显微镜观测细胞中GFP-LC3的点状聚集,通过以上实验观察PFV-Gag蛋白能否引起发自噬。利用免疫荧光（Immunofluorescence,IF）技术观测晚期内体标记物CD63在细胞内的分布;利用Western Blot检测细胞内EEA1和CD63的表达水平,通过以上实验观察PFV-Gag蛋白对晚期内体成熟的影响。4.应用真核生物基因表达技术在HEK293T细胞中表达PFV-Gag蛋白,使用U18666A抑制HEK293T细胞中晚期内体的成熟,利用Western Blot检测HEK293T细胞中LC3脂化和p62降解,通过以上实验观察PFV-Gag蛋白引发的自噬与内体成熟的相关性。5.应用真核生物基因表达技术在HEK293T细胞中表达PFV的全长Gag蛋白或L-domain缺失的Gag蛋白,使用Western Blot检测HEK293T细胞中LC3脂化和p62降解,通过以上实验观察L-domain在PFV-Gag蛋白引发的自噬中的作用。利用IF实验检测CD63和LAMP1在细胞内的分布以及共定位,通过该实验观察L-domain在PFV-Gag蛋白促进成熟Amphisome形成中的作用。6.应用真核生物基因表达技术在HEK293T细胞中表达PFV-Gag蛋白,利用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）实验检测PFV-Gag蛋白与Alix和ESCRT-I必须组成分子肿瘤易感性基因101蛋白（Tumor susceptibility gene101,TSG101）的相互作用,应用RNA干扰技术抑制Alix的表达,利用Co-IP实验检测PFV-Gag蛋白与TSG101相互所用。通过以上实验观察Alix在募集ESCRT-I复合物中的作用。7.应用真核生物基因表达技术在表达GFP-LC3的HEK293T细胞中表达PFV的全长Gag蛋白或L-domain缺失的Gag蛋白,利用IF实验检测CD63和LC3在细胞内的分布以及共定位,通过该实验观察L-domain在PFV-Gag蛋白引发细胞内Amphisome形成中的作用。8.应用RNA干扰技术抑制HEK293T细胞中Alix的表达,通过真核生物基因表达技术在HEK293T细胞中表达PFV-Gag蛋白,利用IF实验检测CD63和LAMP1在细胞内的分布以及共定位;利用Western Blot检测HEK293T细胞中LC3脂化和p62降解,通过以上实验观察Alix在PFV-Gag蛋白促发成熟Amphisome形成中的作用。9.使用聚肌苷酸-聚胞苷酸（Polyinosinic–polycytidylic acid,poly I:C）处理HEK293T细胞,应用真核生物基因表达技术在HEK293T细胞中表达PFV-Gag蛋白,应用IF技术观察G3BP1和TIA1共定位斑点的数目,通过该实验观测PFV-Gag蛋白对poly I:C刺激形成的应激颗粒（Stress granule,SG）的影响。应用双荧光素酶报告基因实验检测IFN-β的启动子活性,应用RT-PCR检测ISG56的转录水平,通过以上实验观察PFV-Gag蛋白对IFN-I反应的调节作用。10.应用真核生物基因表达技术在表达GFP-LC3的HEK293T细胞中表达PFV-Gag蛋白,使用poly I:C处理细胞,应用IF技术检测CD63、LC3和G3BP1的细胞内分布,以此观测Amphisome与SG的共定位。11.利用RNA干扰技术抑制HEK293T细胞中Atg5的表达以抑制自噬的启动,应用真核生物基因表达技术在HEK293T细胞中表达PFV-Gag蛋白,使用poly I:C处理细胞,应用IF技术观察G3BP1和TIA1共定位斑点的数目,以此观测自噬在PFV-Gag蛋白对poly I:C刺激形成的SG影响中的作用。12.应用真核生物基因表达技术在HEK293T细胞中表达PFV的全长Gag蛋白或L-domain缺失的Gag蛋白,使用poly I:C处理细胞。应用IF技术观察G3BP1和TIA1共定位斑点的数目,以此观测L-domain在PFV-Gag蛋白对poly I:C刺激形成的SG影响中的作用。应用双荧光素酶报告基因实验检测IFN-β的启动子活性,应用RT-PCR检测ISG56的转录水平,通过以上实验观察L-domain在PFV-Gag蛋白对IFN-I反应调节中的作用。13.利用RNA干扰技术抑制HEK293T细胞中Alix或TSG101的表达以阻止PFV-Gag蛋白对ESCRT-I的募集,应用真核生物基因表达技术在HEK293T细胞中表达PFV-Gag蛋白,使用poly I:C处理细胞,应用IF技术观察G3BP1和TIA1共定位斑点的数目,以观测Alix募集ESCRT-I在PFV-Gag蛋白对poly I:C刺激形成的SG的影响中的作用。14.利用RNA干扰技术抑制HEK293T细胞中Alix的表达,应用真核生物基因表达技术在HEK293T细胞中表达PFV-Gag蛋白,使用poly I:C处理细胞,应用双荧光素酶报告基因实验检测IFN-β的启动子活性,应用RT-PCR检测ISG56的转录水平,通过以上实验观察Alix在PFV-Gag蛋白对IFN-I反应调节中的作用。15.使用U18666A处理细胞以抑制内体成熟,使用真核生物基因表达技术在HEK293T细胞中表达PFV-Gag蛋白,使用poly I:C处理细胞,应用双荧光素酶报告基因实验检测IFN-β的启动子活性,应用RT-PCR检测ISG56的转录水平,通过以上实验观察内体成熟在PFV-Gag蛋白对IFN-I反应调节中的作用。16.利用RNA干扰技术抑制HEK293T细胞中Rab7a或EPG5的表达,以抑制Amphisome形成,应用真核生物基因表达技术在HEK293T细胞中表达PFV-Gag蛋白,使用poly I:C处理细胞,利用IF技术观察G3BP1和TIA1共定位斑点的数目,以此观察Amphisome在PFV-Gag蛋白对poly I:C刺激形成的SG影响中的作用;应用双荧光素酶报告基因实验检测IFN-β的启动子活性,应用RT-PCR检测ISG56的转录水平,以此观察Amphisome在PFV-Gag蛋白对IFN-I反应调节中的作用。结果:1.Western Blot检测结果显示:PFV促进HT1080细胞中LC3脂化和p62降解;PFV-Gag蛋白促进HEK293T细胞中LC3脂化和p62降解以及EEA1和CD63的表达;U18666A处理能够抑制表达PFV-Gag蛋白的HEK293T细胞中p62降解而对LC3脂化无影响;与表达全长PFV-Gag蛋白的HEK293T细胞相比较,表达缺失L-domain的PFV-Gag蛋白的HEK293细胞中LC3脂化无明显改变而p62的降解减低;抑制Alix表达,使表达PFV-Gag蛋白的HEK293T细胞中p62的降解减少而LC3的脂化无变化。2.共聚焦荧光显微镜观察到感染PFV的HT1080的细胞和表达PFV-Gag蛋白的HEK293T细胞中出现GFP-LC3的点状聚集。3.IF实验结果显示:表达PFV-Gag蛋白的HEK293T细胞中CD63标记的晚期内体增多;在表达PFV的全长Gag蛋白的HEK293T细胞中存在LC3与CD63共定位的斑点及LAMP1与CD63共定位的斑点;与表达PFV的全长Gag蛋白的HEK293T细胞相比较,表达缺失L-domain的PFV-Gag蛋白的HEK293细胞中LC3与CD63共定位斑点的数目以及LAMP1与CD63共定位斑点的数目明显下降;抑制Alix表达,使表达PFV-Gag蛋白的HEK293T细胞中CD63与LAMP1共定位斑点数明显降低;在表达PFV-Gag蛋白的HEK293T细胞中,poly I:C持续刺激后,存在CD63、LC3和G3BP1共定位的斑点;抑制Atg5、Alix或TSG101的表达,使表达PFV-Gag蛋白的HEK293T细胞中由持续poly I:C刺激导致的G3BP1和TIA1共定位斑点的数目增加;与表达PFV的全长Gag蛋白的HEK293T细胞相比较,表达缺失L-domain的PFV-Gag蛋白的HEK293细胞中由持续poly I:C刺激导致的G3BP1和TIA1共定位斑点的数目增加。4.双荧光素酶报告基因实验结果显示:抑制Atg5表达或巴佛洛霉素A1处理均使感染PFV的HT1080细胞中IFN-β的启动子活性增高;受持续poly I:C刺激,表达PFV-Gag蛋白的HEK293T细胞中IFN-β的启动子活性降低,抑制Alix的表达或U18666A处理能够使IFN-β的启动子活性增高,抑制Rab7a或EPG5的表达,能够使IFN-β的启动子活性增高;与表达PFV的全长Gag蛋白的HEK293T细胞相比较,表达缺失L-domain的PFV-Gag蛋白的HEK293细胞受持续poly I:C刺激后IFN-β的启动子活性增加。5.Co-IP实验结果显示:表达PFV-Gag蛋白的HEK293T细胞中PFV-Gag蛋白能够与Alix和TSG101相互作用;缺失L-domain的PFV-Gag蛋白不能够与Alix和TSG101相互作用;抑制Alix的表达,PFV-Gag蛋白不能够与TSG101相互作用。6.RT-PCR检测结果显示:抑制Atg5表达或巴佛洛霉素A1处理均使感染PFV的HT1080细胞中ISG56转录水平增高;受持续poly I:C刺激,表达PFV-Gag蛋白的HEK293T细胞中ISG56的转录水平降低;抑制Alix的表达或U18666A处理能够使ISG56转录水平增高;抑制Rab7a或EPG5的表达能够使ISG56转录水平增高;与表达PFV的全长Gag蛋白的HEK293T细胞相比较,表达缺失L-domain的PFV-Gag蛋白的HEK293细胞受持续poly I:C刺激后ISG56转录水平增加。结论:PFV能够引发细胞自噬以抑制IFN-I反应。该病毒Gag蛋白能够引发内体相关性自噬,其L-domain与Alix相互作用募集ESCRT-I促进内体相关性自噬中间囊泡Amphisome的形成,这会促发应激颗粒的自噬降解,即“粒噬”。PFV-Gag蛋白可通过以上机制抑制IFN-I反应。