免疫系统是机体在进化过程中形成的一种可以通过多种屏障来识别“自己”和“非己”的系统。黏膜免疫是抵抗外源入侵的第一道屏障。当“非己”成分入侵机体后可以被机体的模式识别受体(PRRs)所识别,并引起信号转导,从而促进某些核转录因子的激活并入核进而调节相关基因的表达。其中第一个被确认的模式识别受体就是TLRs家族。本研究一方面通过构建TGEV结构蛋白和非结构蛋白真核表达载体研究其对细胞FcRn表达的影响,并挖掘病毒相关蛋白的功能域;另一方面研究TGEV、UV-TGEV以及TGEV蛋白引起细胞FcRn表达上调的相关TLRs信号通路。取得的主要研究成果如下:1.TGEV对细胞FcRn表达的影响TGEV感染PK-15细胞或IPEC-J2细胞后,通过荧光定量PCR、双荧光素酶报告系统以及Western Blot实验对细胞FcRn的mRNA和蛋白表达进行检测。结果表明TGEV能引起细胞FcRn mRNA和蛋白表达显著上调。2.TGEV蛋白对细胞FcRn表达的影响本研究通过紫外线灭活TGEV,并用不同剂量的UV-TGEV刺激PK-15细胞后通过双荧光素酶报告系统和Western Blot检测发现UV-TGEV能够显著上调FcRn mRNA和蛋白表达水平。说明TGEV的结构蛋白参与了细胞FcRn表达的调控。与TGEV活病毒刺激相比,UV-TGEV上调细胞FcRn程度较低,这说明除病毒核酸以外,TGEV的非结构蛋白也可能参与了对FcRn的表达调控。3.TGEV蛋白真核表达载体的构建本研究通过提取TGEV WH-1株的RNA,反转录获得cDNA,并以此为模板,应用TGEV各蛋白基因的特异性引物分别进行扩增,并将扩增产物回收后经酶切连接到pCAGGS-HA真核表达载体,通过PCR扩增、酶切鉴定及测序验证准确后,再分别将各蛋白重组表达质粒转染PK-15细胞。通过荧光定量PCR和Western Blot检测FcRn的表达水平。结果表明结构蛋白M、N和E以及非结构蛋白nsp1、nsp5、nsp7、nsp8、nsp9、nsp15均可以上调细胞FcRn的表达。4.TGEV M和N蛋白截短表达载体的构建为了探究M蛋白和N蛋白调控FcRn表达的结构功能域,本研究通过构建不同的截短蛋白表达质粒并转染PK-15细胞,通过Western Blot和荧光定量PCR实验对细胞FcRn表达水平进行检测。最终确定N蛋白有效功能域位于156-198位氨基酸,M蛋白有效功能域位于219-262位氨基酸。5.探究TGEV上调FcRn表达的相关TLRs信号通路本研究对TGEV、UV-TGEV以及TGEV蛋白上调细胞FcRn的表达是否通过激活TLRs相关通路进行调控展开了研究。首先将MyD88和TRIF负调控质粒转染PK-15细胞,再应用TGEV和UV-TGEV刺激细胞,然后通过检测细胞FcRn表达水平的变化,证实了TGEV和UV-TGEV均能通过TLRs通路上调细胞FcRn蛋白的表达;通过荧光定量PCR检测证实了TGEV感染细胞能够激活TLR1、TLR2、TLR3、TLR4和TLR6的表达,UV-TGEV能够激活TLR1和TLR2。进一步将能上调FcRn表达的各种TGEV蛋白表达质粒分别转染细胞后发现nsp1、nsp5、nsp7、nsp8、nsp9、nsp15等六种非结构蛋白后均能显著激活TLR1、TLR2、TLR4和TLR6,结构蛋白E能显著激活TLR2、TLR4和TLR6,截短蛋白N1能显著激活TLR1、TLR4和TLR6,截短蛋白M2能激活TLR2和TLR4。