由于遗传或者是获得性的原因,在基因正常终止密码子的上游产生了一个终止密码子,称为早发性无义突变(PTC)。大约有三分之一的人类疾病是由于早发性无义突变引发的,其中主要包括遗传性疾病和癌症类疾病,本文主要针对的两种疾病：血友病B是一种X染色体连锁的隐性遗传性疾病,是由编码凝血因子Ⅸ基因(F9)突变导致的先天性凝血机制障碍疾病,根据血友病数据库统计,早发性无义突变占F9基因突变中的11.1%；多发性内分泌腺瘤病Ⅰ型(MEN1)是一种常染色体显性遗传癌症类疾病,作为抑癌基因的MEN1,其上80%的突变是无义突变或是移码突变,导致肿瘤的发生。早发性无义突变引发的疾病在传统的治疗上以替代疗法、手术、放疗和化疗为主,翻译通读治疗(TBT)在近年来逐步成为治疗早发性无义突变疾病的主要策略之一,翻译通读治疗以促通读药物作用于早发性无义突变位点,使带有PTC的基因发生通读效应,表达出全长的具有功能的蛋白。氨基糖苷类药物(G418等)和非氨基糖苷类药物(PTC124等),作为促通读药物,在PTC引发疾病的治疗中具有一定的疗效,但是不同患者的疗效差异很大,影响通读效率的因素有很多：促通读药物的选择、PTC所在基因位置的上下文结构以及无义突变介导的mRNA降解途径(NMD),这些影响因素的检测和考量是个体化治疗的前提和基础。另外,大量促通读候选药物亦需要高通量的筛选体系来完成筛选过程。首先,本研究针对促通读药物的研究需求,利用绿色荧光蛋白(EGFP)基因和红色荧光蛋白(DsRed)基因构建早发性无义突变双荧光筛选体系,该体系包括双荧光哺乳动物表达载体pDsRed-EGFPmtag-及其早发性无义突变体pDsRed-EGFPmtag-Y445X,该体系转染哺乳动物细胞COS7后,载体能够进行正确的表达,并且能被流式细胞仪检出。转染早发性无义突变体pDsRed-EGFP mtag-Y445X的细胞经促通读药物PTC124处理,通过流式细胞仪测定荧光蛋白的平均荧光强度,可以精确得出促通读药物的通读效率,而且发现PTC124的促通读效果与作用浓度呈现一定的量效关系,随后实时荧光定量PCR反应对目标基因EGFP的mRNA的定量检测,同样证实了PTC124具有剂量依赖性的促通读活性。通过以上实验,说明该筛选体系克服了现行荧光素酶表达体系荧光素底物假阳性的缺点,能够快速准确的反映药物促通读活性。该载体采用双荧光报告基因系统,以DsRed红色荧光作为内标,排除了共转染等操作步骤带来的系统误差,可以精确计算PTC的通读效率；该载体预留的多克隆位点,可以插入带有PTC及其上下文结构的基因片段,最大程度的模仿促通读药物作用的细胞环境,对通读药物的效果做出精确的测量。其次,本研究以遗传性疾病血友病B的F9基因为研究对象,将F9基因的编码序列导入双荧光哺乳动物表达载体pDsRed-EGFPmtag-,构建了表达载体pDsRed-F9-EGFPmtag-,并根据血友病数据库中登记的点突变构建了该载体的3个无义突变体Y22X、E258X和E296X。突变体转染细胞COS7后,氨基糖苷类药物G418和非氨基糖苷类药物PTC124分别处理细胞,流式细胞仪检测和qRT-PCR检测发现PTC1 24的促通读效果要优于G418,利用凝血因子Ⅸ促凝活性检测试剂盒测试部分支持上述结果。再次,本研究以癌症类疾病多发性内分泌腺瘤病Ⅰ型的MEN1基因为研究对象,在本小组的研究中发现,通过构建MEN1基因的小基因,转染HeLa细胞,促通读药物作用后,MENI基因由于其上的PTC而受到NMD途径调控,促通读药物PTC124能提高menin全长蛋白的表达量,但是得到的nenin全长蛋白功能恢复情况得不到确切的反映。本研究以干扰质粒pSIR-MEN1-10转染Hela细胞,干扰MEN1表达,qRT-PCR检测发现MEN1的效应基因Caspase 8伴随MEN1的敲减而下调,流式细胞仪检测减缓了细胞的凋亡,为PTC124的促通读效果给出了功能水平上的直接证据。最后,本研究扩展了无义突变促通读药物双荧光筛选体系的应用范围：构建了带有双标签(HA tag和c-Myc tag)的凝血因子Ⅸ小基因Ⅱ(Mini-hF9-Ⅱgene),该小基因由三部分组成：外显子1-7+内含子7+外显子8。构建了含有Mini-hF9-Ⅱ基因的重组表达质粒pCMV-3B-Mini-hF9-Ⅱ,并将其转染到细胞中,通过RT-PCR及Western Blot分析发现,小基因可以正确剪切、拼接和表达全长蛋白。导入筛选体系后,将能从EJC模型的角度考查NMD途径对促通读药物的影响；本文分离并通过细胞形态学、表面抗原以及多向分化能力等方法鉴定了间充质干细胞(MSCs),并且将双荧光筛选体系初步转染了间充质干细胞。间充质干细胞来源广泛,易于分离培养,并且具有较强的分化潜能,外源基因易于植入间充质干细胞,并且植入的基因易于在间充质干细胞内稳定的表达而不影响其特性,对于间充质干细胞而言,植入外源基因引发的损伤小,反应弱,将此双荧光筛选体系和间充质干细胞结合起来,为构建促通读药物筛选的间充质干细胞模型,更为下一步促通读药物筛选的动物模型体内示踪,以及接近观察药物筛选体系对抗肿瘤药物的作用效果奠定了基础。利用此无义突变促通读药物双荧光筛选体系,在体外表达可以高通量检测不同环境,不同条件下的药物作用效果,为阐明细胞中无义突变的翻译调控机制,丰富PTC引发的疾病病因学知识提供了基础；有助于判断遗传疾病以及肿瘤的分型和预后,并为进一步分子靶向治疗提供分子依据；对候选药物的高通量筛选,为实施个性化治疗提供帮助。