论文部分内容阅读
目的：观察正常C57BL/6小鼠与p16ink4a缺失小鼠缝线法诱导角膜新生血管的生长规律及异同点,对比两者中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体和色素上皮细胞衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)在角膜新生血管生长过程中表达量的变化及其与角膜新生血管的关系,探讨p16ink4a在角膜新生血管稳态维持中的作用及其机制。方法：1.缝线法建立小鼠角膜新生血管模型。选取正常C57BL/6小鼠作为正常小鼠组、p16ink4a缺失小鼠作为p16缺失组。小鼠常规麻醉,用角膜环钻轻压小鼠角膜中央,形成直径2mm的角膜压痕以定位缝线,11-0尼龙线垂直压痕放射状做3针缝线。2.裂隙灯大体观察新生血管生长情况。从建模到缝线术后14天,通过裂隙灯观察两组小鼠角膜新生血管的生长情况,分析其发生的大体时间、形态、密度及范围等差异。3.免疫荧光法分析新生血管生长情况并检测角膜VEGF及其受体和PEDF的表达。缝线术后5天取材冰冻切片,应用VEGF-A、VEGF-R1 、VEGF-R2、VEGF-R3与CD31进行双重免疫荧光染色,观察对比两组小鼠角膜新生血管的分布、密度等生长情况,以及VEGF及其受体、PEDF的表达部位和表达量的变化。4.分子生物学检测两组小鼠角膜VEGF及其受体和PEDF的表达。缝线术后5天取材,分别用RT-PCR方法和western blot方法检测对比两组小鼠角膜组织中VEGF及其受体和PEDF mRNA和蛋白的表达情况。结果：1.正常小鼠组和p16缺失组角膜新生血管的生长情况。p16缺失组小鼠缝线术后血管充盈及角膜水肿情况皆重于正常小鼠组,新生血管侵入角膜基质以及到达缝线位置的时间早于正常小鼠组,且新生血管的密度明显大于同期正常小鼠组。2.免疫荧光结果。角膜新生血管的密度和位置：缝线术后5天p16缺失组小鼠角膜明显水肿增厚,CD31阳性血管内皮细胞表达多于正常小鼠组,血管的密度增加。角膜VEGF及其受体和PEDF的表达：缝线术后5天p16缺失组与正常小鼠组相比较,VEGF-A、VEGF-R1、VEGF-R2表达高,PEDF表达低,VEGF-R3表达无明显差异。3.RT-PCR检测mRNA表达情况：缝线术后5天p16缺失组小鼠VEGF-A、VEGF-R1、VEGF-R2显著性升高(P<0.01),PEDF显著性降低(P<0.01),且变化幅度显著性大于正常小鼠组(P<0.01),缝线术后两组小鼠的VEGF-R3均显著性升高,但两组间差异无统计学意义4.Western blot检测蛋白表达情况：缝线术后5天p16缺失组与正常小鼠组相比较,VEGF-A、 VEGF-R1表达显著性高,PEDF表达显著性低,另外VEGF-A/PEDF的比值p16缺失组显著性大于正常小鼠组。结论：p16ink4a缺失小鼠缝线诱导后产生角膜新生血管的速度、长度及密度大于正常小鼠。血管增生期p16ink4a缺失小鼠VEGF-A表达高、PEDF表达低、VEGF-A/PEDF的比值显著高于正常小鼠,另外得到VEGF-R1、VEGF-R2的表达水平的升高也显著性大于正常小鼠。p16ink4a可能通过调节VEGF及其受体/PEDF的相对表达水平,维持角膜缘血管的稳态。