纳米科技的不断发展，纳米材料广泛地应用于人们日常生活中，而纳米银作为一种新型抗菌材料，是目前商品化程度最高的纳米材料之一，被广泛地应用于卫生、保健、医学等领域。纳米银产品不断地开发和应用，生物体频繁暴露于金属银的环境中，所受到的潜在生物安全性威胁也随之增大，因此纳米银的生物安全性定量评估亟待解决。已有的研究显示纳米银可以通过不同的途径进入生物体，进而随着血液循环到达新陈代谢活跃的器官，多数研究表明纳米银的蓄积和作用靶器官是肝脏。本课题组先前的小鼠急性毒性试验和体内动力学研究也显示，纳米银进入体内可广泛分布于全身各组织器官，而肝脏和脾脏是纳米银蓄积和作用的靶器官。然而体内研究并未对纳米银毒作用机制给出更多解释。体外细胞研究表明，纳米银细胞毒性效应主要表现为降低细胞活力，损伤细胞膜，诱导氧化应激，影响炎症因子分泌，改变细胞间隙连接通讯，损伤DNA，以及诱导细胞凋亡等。由于大多数研究所用的细胞类型不同，纳米银材料特性如粒径大小、表面修饰等的差异，所以对于纳米银细胞毒性的产生机制尚无比较明确一致的解释。此外最近一些研究发现，纳米银对肿瘤细胞的生长有较明显的增殖抑制作用。因此本研究选择靶器官肝脏来源的两种细胞株作为研究对象，人肝癌细胞株HepG2细胞和人正常肝细胞株L02细胞，通过一系列研究比较纳米银对两种细胞的毒性效应差异，进一步探讨其毒性作用机制，为纳米银的生物安全性评价以及在生物医药领域的应用奠定基础。　　为了更好的研究市场化纳米银的毒理学效应，反映人们实际接触的纳米银材料可能具有的潜在威胁，本研究使用商品化的纳米银材料，平均粒径为(23.44±4.92 nm)，表面由聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)包被，比较纳米银对HepG2细胞和L02细胞毒性效应的差异，包括细胞活力、细胞膜损伤、细胞形态的改变以及细胞内纳米银的分布等，并寻找纳米银对两株细胞毒性效应差异的剂量范围，在此剂量下研究探讨纳米银诱导肝细胞凋亡的分子机制。　　1、纳米银材料表征以及细胞培养液中离子动力学研究:①市售纳米银为PVP包被的纳米银材料，通过透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)观察，纳米银颗粒形态为球形，平均粒径为(23.44±4.92 nm)，在细胞培养液中分散均匀，无团聚现象。②马尔文粒径分析仪测得纳米银在细胞培养液中的水合粒径为43.76nm。③在16.0 mg/ml的纳米银-细胞培养液分散液中所释放的银离子浓度几乎可以忽略，且0～48h内释放的银离子水平相对稳定，为后续细胞活力实验奠定基础。　　2、纳米银对HepG2细胞和L02细胞活力影响研究:①比较了MTT和CCK-8两种方法对纳米银暴露细胞活力测定的影响，发现两种方法对两种肝细胞的细胞活力测定结果基本一致。在较低剂量(20、40、80、160μg/ml)下纳米银对两株细胞的细胞活力影响差异具有统计学意义，且染毒24h后，20～80μg/ml纳米银可增强L02细胞活性，而对HepG2产生明显的细胞毒性;而染毒48h后，纳米银对两种细胞的生长增殖均有一定抑制作用，随着纳米银染毒剂量增大，细胞活性逐渐降低，表现出明显的时间-剂量效应。②在CCK-8方法中选择两组银离子对照，分别为高速离心法获得的不同浓度的银离子溶液以及硝酸银溶液。结果表明硝酸银的细胞毒性远远高于纳米银，而纳米银所释放的银离子浓度与纳米银本身剂量有关，只有640μg/ml的纳米银溶液中所释放的银离子对两株细胞产生了一定的毒性效应。而PVP溶液组，对两株细胞活力均无明显影响。故推论纳米银对细胞的生物学效应主要是纳米银单体发挥作用。③LDH法测定细胞膜损伤，结果表明20～160μg/ml纳米银诱导对肝细胞的细胞膜损伤具有时间-剂量效应，且HepG2细胞释放的LDH活力明显高于L02细胞，与MTT及CCK-8测定结果相一致。表明纳米银暴露对两株细胞具有不同的毒性效应，在相同剂量下，HepG2细胞比L02细胞对纳米银更加敏感。　　3、纳米银对HepG2细胞和L02细胞形态的影响及纳米银在细胞内的分布研究:①倒置显微镜观察不同剂量下(0、20、40、80、160μg/ml)纳米银暴露24h或48h后HepG2细胞和L02细胞的细胞形态。HepG2细胞形态明显改变，皱缩变圆，数目减少，而L02细胞形态基本保持正常，有少量细胞收缩，细胞间距离变大，不再聚集生长。②TEM观察高剂量(160μg/ml)纳米银染毒肝细胞，发现纳米银引起两株细胞膜破坏，胞内空泡化增多，核内染色质凝聚边集在核膜周围，线粒体肿胀，嵴消失或断裂，内质网扩张。③TEM高倍镜下观察纳米银在细胞内的分布，发现染毒24h在细胞膜周围分散着纳米银颗粒，而染毒48h后，可在细胞胞质内观察到纳米银颗粒，细胞核内无发现。HepG2细胞的线粒体有黑色颗粒沉着，而L02细胞可在溶酶体和内吞小泡中发现黑色颗粒。纳米银染毒后引起两株细胞的形态改变不同，在细胞内的分布也具有差异。　　4、流式细胞术测定纳米银诱导HepG2细胞和L02细胞凋亡机制研究:①纳米银可诱导两株细胞早期凋亡率升高及线粒体膜电位下降，都具有时间-齐剂量依赖效应。比较HepG2细胞和L02细胞暴露相同时间，相同剂量的纳米银分散液，可发现20～160μg/ml纳米银暴露24h或48h，HepG2细胞的早期凋亡率和线粒体膜电位下降率均明显高于L02细胞，差异具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。并且L02细胞在纳米银暴露24h后，其早期凋亡率和线粒体膜电位下降率均低于10％，即纳米银对L02细胞毒性较小，再次验证细胞活力实验结果。②细胞ROS产生实验发现，纳米银诱导HepG2细胞ROS的产生具有剂量和时间效应;而对L02细胞，无论是染毒24h还是48h，其ROS水平均没有显著升高。因此认为纳米银诱导HepG2细胞凋亡与氧化应激有关，并且纳米银所诱导的HepG2细胞毒性高于L02细胞可能也与此相关。以上研究表明，纳米银诱导HepG2细胞毒性的可能机制是纳米银诱导氧化应激反应，引起ROS产生，促使线粒体膜电位下降，进而诱导细胞早期凋亡。而对于L02细胞可能需要更高的剂量方可诱导相似的凋亡作用。　　5、纳米银诱导HepG2细胞凋亡的分子机制:Western Blotting测定HepG2细胞中凋亡相关蛋白的表达，结果表明纳米银诱导HepG2细胞凋亡机制可能与线粒体途径和肿瘤坏死受体途径有关。其中Cyt C、Caspase3、Caspase8和Caspase9蛋白水平随着剂量升高均明显升高，抗凋亡蛋白分子Bcl-2与促凋亡蛋白分子Bax的比值以及NF-κB蛋白表达水平随着剂量升高逐渐降低。　　综上所述，纳米银对HepG2细胞和L02细胞具有一定的细胞毒性，且纳米银诱导的细胞毒性主要是由纳米银单体发挥作用。在实验研究剂量下(20～160μg/ml)两株细胞表现出不同的细胞毒性效应，HepG2细胞比L02细胞对纳米银更加敏感。造成两株细胞毒性差异的原因可能是纳米银诱导HepG2细胞产生ROS，而L02细胞却没有激发产生ROS，两株细胞早期凋亡率、线粒体膜电位下降率均显示具有显著差异性。通过对HepG2细胞凋亡相关蛋白表达的测定，表明纳米银诱导HepG2细胞凋亡与线粒体依赖途径和肿瘤坏死受体途径有关。因此，纳米银对HepG2细胞毒性作用的机制可能是:纳米银引起HepG2细胞内ROS水平上升，线粒体膜电位降低，使得线粒体受到损伤，线粒体上凋亡因子接受信号，Bcl-2/Bax比例下调，释放出Cyt C，激活下游的Caspase9。同时，肿瘤坏死受体途径激活了Caspase8的表达，从而启动下游的caspase级连反应，最终诱导细胞凋亡。且NF-κB与Bcl-2正相关，对细胞凋亡具有抑制作用。本研究在细胞和分子水平初步阐明了纳米银细胞毒性效应的作用机制，可为纳米银的生物安全研究提供参考，为纳米银在生物医药领域的应用奠定基础。